短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析

旨在从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)XZE116发酵液中分离纯化低温弹性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法进行纯化。结果显示,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了37.21倍,回收率为35.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子量是32.6 kD。最适作用温度25℃。在pH7.5-10.5范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH9.0,Mg2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。酶对阴离子表面活性剂(0.1%SDS)、阳离子表面活性剂(0.1%CTAB)和非离子型表面活性剂(1%Tween80)均具有很强的稳定性。鉴于短芽孢杆菌XZE116弹性蛋白酶具有以上优良酶特性,它在肉品嫩化领域具有潜在的应用价值。     

微生物弹性蛋白酶研究概况

概述了弹性蛋白酶的性质,及在医药、食品和日用化学等方面的重要功用,同时对能够产生胞外弹性蛋白酶的微生物作了详尽的论述。通过微生物发酵法和生化提取法制备弹性蛋白酶的工艺对比得出结论：由微生物发酵法生产弹性蛋白酶成本低,产量大,不受原料限制。若开发出廉价、充足的微生物弹性蛋白酶酶源,必将推动它在各领域的广泛应用。     

桔黄赛多孢霉外泌弹性蛋白酶的生化特性

外泌弹性蛋白酶是桔黄赛多孢霉(Scedosporium aurantiacum)主要毒性蛋白酶之一,本文在前期研究的基础上,对这种蛋白酶的序列、结构和酶学特性进行了研究。首先通过柱层析技术将S. aurantiacum培养上清液中的蛋白进行了分离,然后通过酶谱电泳纯化得到了弹性蛋白酶条带。从凝胶中提取了弹性蛋白酶,通过质谱技术对其序列进行了检测,并对其反应特性、活力和反应动力学参数进行了研究。结果显示,S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对弹性蛋白和牛跟腱胶原蛋白(bovine achilles tendon collagen, BATC)具有较好的水解性能,对鱼皮胶原蛋白(fish skin collagen, FSC)的水解效率高于对鱼鳞明胶的水解效率,对酪蛋白的水解性最差。作用于弹性蛋白时,其催化效率小于猪胰腺弹性蛋白酶。Zn²⁺对酶活力有提升作用,而Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、(2S)-2-[(4S)-2-氨基-1,4,5,6-四羟基4-嘧啶基]-N-[[[(1S)-1-羰基-3-甲基丁基]氨基]羰基]甘氨酰- N1-[(1S)-1-甲基-2-氧乙基]-l-谷氨酸甲酰胺(elastatinal)和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)均对酶活有抑制作用。该蛋白酶和青霉(Paecilomyces lilacinus)外泌丝氨酸蛋白酶(PDB Entry: c3f7oB_)的序列最相似,且有多段保守序列的氨基酸个数多于7个,可以作为PCR反应引物设计的模板。酶学特性实验表明,S. aurantiacum外泌弹性蛋白酶对肺组织中的弹性蛋白具有降解作用,其蛋白表达和毒性机制需要进一步的研究。     

嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶的表达、纯化及特性分析

摘要：【目的】表达、纯化嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的性质进行分析。【方法】以pET-32a为表达载体将弹性蛋白酶基因ahyB转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,表达重组酶用His TaqNi2+亲和层析柱纯化并用6 mol/L盐酸胍进行复性;利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析对嗜水气单胞菌培养上清液中的弹性蛋白酶进行纯化。将【结果】从嗜水气单胞菌培养上清液中获得的弹性蛋白酶原酶的最适pH 为8.5,而表达重组酶为 10.0;对热的稳定性,原酶高于表达酶。两种形式酶的性     

六种蛋白酶酶解效果的研究

本实验利用六种蛋白酶(1、2、3、4、5、6号蛋白酶)分别对豆粕、玉米芽粕、花生粕、菜籽粕、酒糟、黄粉虫、地鳖虫进行酶解,以肽含量为指标研究六种蛋白酶的酶解效果.结果显示,3号蛋白酶对酒糟、黄粉虫、地鳖虫酶解效果明显,酶解液肽含量最高可达12.6 mg·L-1、17.66 mg· L-1和36 mg·L-1;4号蛋白酶对豆粕酶解效果明显,酶解豆粕肽含量达到17.47 mg·L一1;5号蛋白酶对花生粕酶解效果明显,酶解花生粕肽含量最高可达18.45 mg·L1;六种蛋白酶均能酶解菜籽粕,酶解液肽含量均在15 mg·L-1以上,且差异不大.     

蛋白酶B.P与几种试剂蛋白酶的比较

蛋白酶B.P与国内外几种试剂蛋白酶比较,证明其酶种单一,只含有蛋白酶,不含DNA酶和RNA酶,与蛋白酶K和蛋白酶E相似。蛋白酶B.P除含有碱性蛋白酶外还含有较高的中性蛋白酶活性,它可以广泛地水解多种天然蛋白,应用于微生物细胞蛋白的水解,提取DNA和RNA,还可水解叶肉细胞蛋白,提取叶绿体DNA,是我国第一个碱性生化试剂蛋白酶。     

糜酶的研究进展

糜酶是一类丝氨酸蛋白酶,主要存在于肥大细胞的分泌颗粒和细胞间质。成熟的酶为一糖蛋白,由２２６个氨基酸组成,分子量为３０ｋＤ,其酶活力能被丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制,而不受血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂的影响。糜酶的ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ均已被克隆和测序。该酶和神经炎症反应、血管活性肽代谢和细胞外基质代谢等有密切联系,在心脏血管紧张素Ⅱ形成中起重要作用。     

高温中性蛋白酶及其产生菌的初步研究

对高温中性蛋白酶产生菌耐热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)XJT9503的产酶条件及酶的提取进行了初步研究。耐热芽孢杆菌XJT503产酶的摇瓶培养基最适碳源为葡萄糖,最适氮源为豆饼粉,100r／min,46℃培养60h酶活最高。实验结果表明高温中性蛋白酶提取可采用硫酸铵分级沉淀法。     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

牙鲆弹性蛋白酶cDNA全长和蛋白质结构分析

为研究牙鲆丝氨酸蛋白酶家族的功能和及其家族的分子进化规律,从本实验室已构建的牙鲆肝胰脏cDNA文库进行了部分测序,从而筛选出一个弹性蛋白酶新成员：弹性蛋白酶5。在此基础上,结合Genbank数据库中已经提交的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶,对三者蛋白质进行了序列分析和三维结构的比较。牙鲆弹性蛋白酶cDNA包含一个完整的读码框（提交Genbank的登录号为EU873084）。其编码区平均GC含量为54％,推测编码的蛋白质包含296个氨基酸,分子量为29．04KD,等电点为6．14。蛋白序列比较表明它和牙鲆弹性蛋白酶3相似性最高。通过同源建模得到弹性蛋白酶5的三维结构和牛胰凝乳蛋白酶结构相似,包含了2个α螺旋、β个8折叠和13个转角结构。牙鲆弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶中底物结合区的3个关键氨基酸有明显的区别,这些氨基酸的变化改变了底物结合位点开口的大小,胰凝乳蛋白酶2的三个关键氨基酸和牛胰凝乳蛋白酶相同,该区域能接受结构较大的芳香族氨基酸;胰蛋白酶3能更好的结合阳性氨基酸Lys或Arg;而弹性蛋白酶开口很小,只能结合小的残基。上述结果证明了牙鲆丝氨酸蛋白酶家族中的弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶底物结合位点的结构差异决定了其对底物选择的特异性。