从人外周血单个核白细胞分离甲型肝炎病毒

选择HAV-Ag免疫荧光阳性的人血单个核白细胞标本,冻融后接种PLC/PRF/5细胞,分离到两株HAV(NJ-3和H-1株),并经血清学和形态学等鉴定证实。本实验提示:HAV不仅游离存在于血浆内,而且可与血白细胞相伴随。采用免疫荧光法筛选白细胞标本作接种物,方法简单,可作为分离HAV的新材料的来源。     

甲肝病毒（龙甲—25株）在Frhk4细胞上传代特征

应用Frhk4细胞增殖HAV,经较系统研究,建立了稳定的细胞传代方法,病毒增殖条件,获得了较大量的甲肝病毒抗原.HAV龙甲-25株在2BS细胞上传至第六代移到Frh4细胞上连续传至九代,用荧光法(IF)、EMISA夹心法,和免疫电镜方法(IEM)进行检测,结果表明龙甲-25不同代次间的病毒增殖情况不同.我们将龙甲-25HAV在Frhk4细胞上从第七代传至第十六代,分别用IF,ELISA,IEM方法检测,结果是细胞在感染病毒后不同天数的IF结果阳性,病毒传代的代次不同在ELISA和IEM检测中出现不同的结果.在第九代至第十一代的HAV′培养过程中我们改变了病毒培养及收获方法,再重复试验时,出现三种实验方法一致的结果.     

用人胚肺二倍体细胞(2BS和SL7)分离甲型肝炎病毒

用我国建株的两株人胚肺二倍体细胞(2BS和SL7),以35℃为培养温度,直接从急性期甲型肝炎(简称甲肝)患者粪便中分离到4株病毒。该病毒在细胞培养上符合甲肝病毒的增殖特性,经免疫荧光阻断、免疫电镜及中和试验等特异性鉴定,证实为甲肝病毒。原始分离时的比较研究还显示,2BS株人二倍体细胞支持甲肝病毒增殖的能力似较SL7细胞佳。该4株病毒现已在2BS细胞稳定传代,感染滴度较高,被用于减毒活疫苗的育种研究。     

一种甲型肝炎灭活疫苗灭活验证试验方法的建立

目的探讨细胞培养/链特异性RT-PCR方法可否作为甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L-A-1减毒株)的病毒灭活验证试验方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条基因特异性引物,提取HAV基因组RNA,应用设计的正向引物进行反转录,再进行两轮PCR扩增,通过检测HAV复制过程中的负链中间体,对甲肝灭活疫苗灭活验证试验方法进行探讨,并与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验方法进行比较。结果细胞培养/链特异性RT-PCR方法对HAV负链RNA特异、敏感。通过方法学验证试验表明,该方法的特异性、敏感性和重复性均良好。利用此方法对5批甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)进行检测,结果全为阴性,与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验测定结果相同。结论细胞培养/链特异性RT-PCR方法快速、灵敏可靠,可作为检测甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)HAV灭活验证试验的方法。     

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

甲型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞核酸增殖培养模型的建立

目的采用人胚肺二倍体细胞(2BS细胞)培养,结合实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测,开展甲型肝炎病毒(HAV)在2BS细胞核酸增殖培养模型的建立研究。方法将不同浓度的HAV活病毒感染2BS细胞,分别于感染后0、8、10、14、20 d收获HAV感染的细胞,应用已建立的HAV核酸检测和抗原检测方法分别检测HAV病毒核酸含量和抗原含量的动态变化。结果 HAV在2BS细胞中可有效复制和扩增,高剂量组以1×10~4 CCID_(50)/mL HAV感染0 d即可检测到HAV核酸,10～20 d病毒核酸达到峰值7.607 lg copies/μL;中剂量组以1×10~2 CCID_(50)/mL HAV感染6 d可检测到HAV核酸,6～10 d病毒增殖明显(P0.05),14～20 d病毒核酸含量达到峰值7.074 lg copies/μL并趋于稳定;而低剂量组以1 CCID_(50)/mL HAV感染后,10 d HAV开始增殖,20 d病毒核酸含量与中、高剂量组别相近且基本达到峰值;当HAV感染2BS细胞10 d时,病毒核酸检出拷贝数与感染HAV浓度呈良好的线性关系,可根据标准曲线准确反映样品中的HAV活病毒含量。细胞培养结合病毒抗原表达也可有效反映HAV的扩增情况,但较病毒核酸的出现呈明显滞后,且当样品中抗原含量低时,至少需要20 d以上才可完全检测到病毒抗原的表达。结论应用2BS细胞培养和qRT-PCR检测建立了2BS细胞HAV核酸增殖模型,可快速、准确地反映HAV活病毒在细胞中的动态感染和增殖情况,可应用于HAV活病毒的快速定量、病毒特性、药物筛选和疫苗评价等相关研究。     

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾(MEK)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT-PCR对其进行特异性鉴定,证明是甲肝病毒.W株和X株第7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为1∶512、1∶1024,感染滴度(logTCID50/mL)分别为8.17、8.50.只有分离株W可以适应于Vero细胞,第6代21d抗原滴度为1∶256,感染滴度(logTCID50/mL)为8.00.     

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾 (MEK)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X ,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT PCR对其进行特异性鉴定 ,证明是甲肝病毒。W株和X株第 7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为 1∶5 12、1∶10 2 4,感染滴度 (logTCID50 /mL)分别为 8.17、8.5 0。只有分离株W可以适应于Vero细胞 ,第 6代 2 1d抗原滴度为 1∶2 5 6 ,感染滴度 (logTCID50 /mL)为 8.0 0。     

流行性出血热病毒在各种鼠类巨噬细胞和人外周血白细胞培养中的增殖

本文证实了流行性出血热病毒(EHF)在体外培养的长爪沙鼠、金黄地鼠、Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞和人外周血白细胞及单核细胞中的增殖。沙鼠和地鼠腹腔巨噬细胞对EHF病毒的敏感性要高于Vero-E_6细胞,而Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞的敏感性却低于其他三种培养的细胞。野鼠型EHF病毒(A_9株)和家鼠型EHF病毒(R_(22)株)在三种鼠腹腔巨噬细胞中的繁殖能力未见明显差异。在人外周血白细胞中,其单核细胞对EHF病毒(A_9株)的敏感性高于淋巴细胞。病毒感染单核细胞后4天的病毒滴度可达10~(-3.0)。以上结果说明EHF病毒在单核巨噬细胞中能繁殖和释放感染性病毒,这表明单核巨噬细胞在鼠、人体内EHF病毒感染的建立及病毒在体内扩散至各器官过程中可能起很重要的作用,即起其靶细胞和扩散媒介的作用。     

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。     

用人胚肺二倍体细胞株分离一株甲型肝炎病毒

自甲型肝炎患者粪便中分离到一株甲型肝炎病毒(TZ-84)。病毒不产生细胞病变,胞浆中有颗粒性荧光。细胞中的病毒抗原能被抗甲肝病毒抗体阳性血清所中和。 TZ-84株病毒耐酸,耐乙醚。免疫电镜见有大量直径27～30mm的甲肝病毒颗粒,以空心为主。将其接种细胞后的黑暗期随传代而缩短,病毒滴度则随传代而增加。将细胞粉碎后获得的病毒。ELISA滴度为1:16。用其检测45份人血清中抗HAV-IgM抗体,并与Abbott ELISA药盒比较,符合率为91.1％,敏感度为87.1％。     

Adherence of Peripheral Blood Leukocytes to Cytomegalovirus-Infected Fibroblasts

Peripheral blood monocytes and B cells adhered to cytomegalovirus (CMV)-infected fibroblasts, whereas T cells and polymorphonuclear leukocytes did not adhere to either CMV-infected or uninfected fibroblasts. When T cells were activated with anti-CD3 antibody, activated T cells demonstrated adherence and cytotoxicity to both CMV-infected and uninfected fibroblasts. Adherence of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and cytotoxicity mediated by adherent activated T cells were blocked by treatment of CMV-infected fibroblasts with anti-ICAM-1 antibody and by treatment of leukocytes with anti-LFA-1 antibody. These data suggest that an interaction of ICAM-1 and LFA-1 is responsible for the adherence of leukocytes and for adherent activated T cell-mediated cytotoxicity against CMV-infected fibroblasts.     

登革热Ⅳ型病毒在地鼠肾细胞培养内减毒的研究

本文报道登革热Ⅳ型病毒Ban18株通过原代地鼠肾细胞连续传代后的适应和减毒过程。 Ban18原株对原代地鼠肾细胞无病变或仅有极轻微病变,对乳小白鼠及断乳鼠的脑内毒力高达LD_(50)为Log6—7。通过连续传20—70代后,病变逐渐加重,出现时间缩短,二天即可达到细胞完全破坏。培养液内的病毒含量也随之提高达10~6—10~7/ml TCID_(50)。但随着传代代数增加,病毒对乳小白鼠的嗜神经毒力逐渐降低,脑内接种后仅个别发病或完全不致死。脑组织病理变化也较原株明显减轻,接种树鼩不产生病毒血症。以上结果符合弱毒株的减毒指标,是一株有希望的活疫苗毒株。     

从海水毛蚶中分离出甲型肝炎病毒

1988年初上海发生甲肝暴发流行,流行病学分析与生食毛蚶有关,本文报道在引起甲肝暴发流行的毛蚶产地江苏启东海域采集毛蚶标本,取腮和消化系统制成40％悬液,用FRhk_4细胞分离甲肝病毒,每代培养21天,连续传二代后经过免疫荧光,ELISA,HAVeDNA斑点杂交试验,免疫电镜等鉴定,5份标本全部阳性,上述结果证实毛蚶中携带甲肝病毒,并为病原学研究提供依据。     

从抗体阳性的甲型肝炎接触者粪便中分离出一株甲型肝炎病毒

几年来,国内外已相继用组织培养法分离多株甲型肝炎病毒(HAV),并已证实了甲型肝炎患者及亚临床型感染在传染本病中的重要性。但HAV在流行点的正常人群中存在短期携带的问题还尚未见报道。本文采用人胚肺二倍体细胞(2BS)从甲型肝炎接触者粪便中分离出一株HAV,并经免疫电镜、免疫荧光及参比血清鉴定等证实。现将结果报告如下。