大肠杆菌SLT—IIvB基因的克隆和表达

采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从大肠杆菌Ｏ１３８基因组ＤＮＡ中分别扩增出志贺菌样毒素ＩＩ型变体Ｂ的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因,定向克隆进表达载体质粒ｐＹＡ３３３４（ａｓｄ＾＋）的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点之间,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌Ｘ６２１２（△ａｓｄ）筛选出重组质粒ｐＢ０和ｐＢ１后,经中间宿主Ｘ３７３０转化过渡,再导入△ａｓｄ△ｃｙａ△ｃｒｐ减毒鼠伤寒沙门氏菌Ｘ４５５０,构建成     

CS3菌毛抗原和霍乱毒素B亚基在人伤寒菌中的表达

通过体内外重组的方法,构建了人伤寒菌流行株Ｔｙ２的△ａｒｏＡ,△ａｒｏＣ和ａｓｄ＾－基因缺失突变体（ＲＳ４１７）作为抗原载体菌：同时,构建包含ａｓｄ基因的表达质粒ｐＹＸ１０２,与ＲＳ４１７一起,构成宿主－载全平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因,将肠毒素性大肠杆菌的菌毛抗原ＩＩＩ（ＣＳ３）基因和霍乱弧菌毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因分别克隆至ｐＹＸ１０２     

湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离,克隆和序…

采用加端聚合链反应技术,从湖北地区一宫颈癌患者癌组织ＤＮＡ中分离出人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因,并在ｐＵＣ１８载体中克隆,经限生核酸内切酶分析和ＤＮＡ序列分析,确认了含ＨＰＶ１６Ｅ７重组克隆质粒,命名ｐｆＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ。ＤＮＡ序列分析表明,ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ基因全长２９４ｂｐ（与报道的标准基因长度相同）但其核苷酸顺序中的两处发生了Ｃ－（Ｔ）突变,即第４３位密码子ＣＡＡ变为ＴＡＡ     

产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性？…

用ＰＣＲ方法从产气肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）中克隆出０．９ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序证明是α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,α－ＡＬＤＣ）基因。将α－ＡＬＤＣ基因重组到质粒,ｐＢＶ２２０后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。     

表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

将编码霍乱ＣＴ－Ｂ和ＬＰＳ－Ｏ抗原的基因与载体质粒ｐＹＡ２４８重组后,转入△ｃｙａ△ｃｒｐ△ａｓｄ减毒鼠伤寒疫苗株ｘ４０７２构建成无药物抗性,带双价抗原的工程菌株ｘ４０７２（ｐＭＧ３０６）。该菌株能分泌表达特异的霍乱ＣＴ－Ｂ抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的Ｏ抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型献计霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础     

木糖代谢基因表达水平对酿酒酵母重组菌株产物形成的影响

以Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ穿梭质粒ＹＥｐ２４为骨架,将树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ６０５４）的木糖还原酶（ＸＲ）基因ＸＹＬ１及木糖醇脱氢酶（ＸＤＨ）基因ＸＹＬ１分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ｉ（ＡＤＨ１）启动子和磷酸甘油激酶（ＰＧＫ）启动子下,构建不同ＸＹＬ１及ＸＹＬ２的重组质粒。这些重组质粒分别转化酿酒酵母（Ｈ１５８）受体菌。得到的重组菌株     

YY1抑制效应的破坏可促进人乳头瘤病毒16型癌基因的转录

人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）癌基因的表达受病毒早期启动子Ｐ９７的控制。位于ＬＣＲ上ＹＹ１蛋白结合位点的破坏可明显提高Ｐ９７的活性。为了观测ＹＹ１位点破坏在全基因组范围内对病毒ｅ６／ｅ７基因转录的影响,将构建的带有ＬＣＲ特异性突变的重组ＨＰＶ１６全基因组ＤＮＡ和ＨＰＶ１６野毒株ＤＮＡ转染至培养细胞,同时组建ＨＰＶ１６Ｅ６反向序列ＲＮＡ体外转录质粒。ＲＮａｓｅ保护试验证实,突变ＨＰＶ１６ＤＮＡ在短     

人乳头瘤病毒16碧蓝晚期基因L1在大肠杆菌中的表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与宫颈癌的发生关系密切。其晚期蛋白Ｌ１是主要结构蛋白,可以刺激机体产生中和抗体,对病毒攻击可以起到保护作用。本研究将ＨＰＶ１６型中国分离株的Ｌ１基因定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２１ｃ质粒中,建立ＨＰＶ１６ Ｌ１在大肠杆菌中的高效表达系统ｐＥＴ２１ｃ－ＨＰＶ１６ Ｌ１,该系统在ＩＰＴＧ的诱导下可表达６０ｋｕ的Ｌ１蛋白,表达效率为２３％,此蛋白通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ得     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ,Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ,简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。     

湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离、克隆和序列分析

采用加端聚合酶链反应技术,从湖北地区一宫颈癌患者癌组织ＤＮＡ中分离出人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因,并在ｐＵＣ１８载体中克隆。经限制性核酸内切酶分析和ＤＮＡ序列分析,确认了含ＨＰＶ１６Ｅ７重组克隆质粒,命名ｐＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ。ＤＮＡ序列分析表明,ＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ基因全长２９４ｂｐ（与报道的标准株基因长度相同）,但其核苷酸顺序中有两处发生了Ｃ→Ｔ突变,即第４３位密码子ＣＡＡ变为ＴＡＡ,第７６位ＣＧＴ变为ＴＧＴ;前者使谷氨酰胺密码子变为终止密码,即无义奕变（ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎ）。这种突变发生在２９４个碱基的ＤＮＡ扩增产物之中,不像是ＰＣＲ本身的错配,而很可能是湖北株与标准株之间的结构差异。     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆和高效表达

利用基因克隆技术,将ＨＰＶ１６湖北株完整的Ｅ７基因克隆到含乳糖操纵子的表达载体ｐＷＲ５９０１上,经限制性酶切分析获得重组质粒ｐＷＨＢＥ７。ｐＷＨＢＥ７转化大肠杆菌后表达产生分子量为７０ｋＤ的融合蛋白ｌａｃＥ７,该蛋白在免疫印迹实验中可被标准Ｅ７单抗识别。经ＩＰＴＧ诱导后,Ｅ７融合蛋白产量可达细菌总蛋白含量的３０％以上。利用ｌａｃＥ７蛋白在细菌胞浆中形成包含体的性质,简便地提取并纯化了该蛋白质。结果为从免疫学角度探讨ＨＰＶ１６与宫颈癌的关系以及ＨＰＶ疫苗的研制打下基础。     

表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建及免疫效果观察

采用基因工程方法将HPV16E6、E7基因融合后插入痘苗病毒载体,通过同源重组构建表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗,用C57BL/6小鼠观察其免疫原性和抗肿瘤移植情况。测序结果表明融合的HPV16E6、E7基因序列与设计相符;构建的非复制型重组痘苗病毒经Dot blot鉴定,显示有E6、E7融合基因的插入;Western blot检测表明该重组病毒在鸡胚成纤维细胞中能表达HPV16型E6/E7融合蛋白。动物免疫试验表明,该重组病毒在小鼠体内可诱发E6、E7特异性抗体;被免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击。此结果为将来进一步研制HPV16、18型联合疫苗打下了基础。     

Construction of prophylactic human papillomavirus type 16 L1 capsid protein vaccine delivered by live attenuated Shigella flexneri strain sh42

To express human papillomavirus （HPV） L 1 capsid protein in the recombinant strain of Shigella and study the potential of a live attenuated Shigella-based HPV prophylactic vaccine in preventing HPV infection, the icsA/virG fragment of Shigella-based prokaryotic expression plasmid pHS3199 was constructed. HPV type 16 L1 （HPV16L1） gene was inserted into plasmid pHS3199 to form the pHS3199-HPV16L1 construct, and pHS3199-HPV 16L1 was electroporated into a live attenuated Shigella strain sh42. Western blotting analysis showed that HPV 16L 1 could be expressed stably in the recombinant strain sh42-HPV 16L 1. Sereny test results were negative, which showed that the sh42-HPV16L1 lost virulence. However, the attenuated recombinant strain partially maintained the invasive property as indicated by the HeLa cell infection assay. Specific IgG, IgA antibody against HPV16L1 virus-like particles （VLPs） were detected in the sera, intestinal lavage and vaginal lavage from animals immunized by sh42-HPV 16L1. The number of antibodysecreting cells in the spleen and draining lymph nodes were increased significantly compared with the control group. Sera from immunized animals inhibited mufine hemagglutination induced by HPV 16L1 VLPs, which indicated that the candidate vaccine could stimulate an efficient immune response in guinea pig＇s mucosal sites. This may be an effective strategy for the development of an HPV prophylactic oral vaccine.     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

人乳头瘤病毒16L1-减毒志贺氏杆菌为载体疫苗的构建及免疫效应初步鉴定

为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPVl6感染的目的。为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果。利用基于志贺氏杆菌virG／icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌。用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性。免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性。减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1 VLPIgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1 VLP引起的小鼠红细胞凝集。因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗。     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

Efficient secretion of a modified E7 protein from human papilloma virus type‐16 by Lactococcus lactis

Aims: To create and provide a strain of the food‐grade bacterium Lactococcus lactis able to efficiently secrete a modified form of the E7 protein from the human papilloma virus (HPV) type‐16. Methods and Results: We cloned the coding sequence of a modified E7 (E7m) from the HPV‐16 in a plasmid regulated by the strong expression promoter p59. Secretion of the E7m was made by the signal peptide of the usp45 gene. The E7m was detected by Western blot in the cell‐free‐medium fraction, showing no degradation or aberrant forms. Conclusions: We constructed a strain of L. lactis able to secrete efficiently a HPV‐16 E7 modified protein with diminished transforming activity. Significance and Impact of the Study: Human papilloma virus infection is associated with more than 99% of cervical cancers. Immunotherapy targeting E7 to treat HPV‐associated cervical malignancies has been demonstrated to be highly efficient. However, native E7 maintains transforming activity. We present this new strain of a food‐grade bacterium able to efficiently secrete a HPV‐16 E7‐modified protein with diminished transforming activity. This new strain could be used as a live vaccine to deliver E7 at a mucosal level and generate antitumour immune responses against HPV‐associated tumours.     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

Transforming activity of a novel mutant of HPV16 E6E7 fusion gene

An optimized recombinant HPV16 E6E7 fusion gene(HPV16 ofE6E7)was constructed according to codon usage for mammalian cell expression,and a mutant of HPV16 ofE6E7 fusion gene(HPV16 omfE6E7)was generated by site-directed mutagenesis at L57G,C113R for the E6 protein and C24G,E26G for the E7 protein for HPV16 ofE6E7 [patent pending(CN 101100672)].The HPV16 omfE6E7 gene constructed in this work not only lost the transformation capability to NIH 3T3 cells and tumorigenicity in SCID mice,but also maintained very good stability and antigenicity.These results suggests that the HPV16 omfE6E7 gene should undergo further study for application as a safe antigen-specific therapeutic vaccine for HPV16-associated tumors.