Activation of STAT3 stimulates AHSP expression in K562 cells

Studies on the chaperone proteinα-hemoglobin stabilizing protein(AHSP)reveal that abundant AHSP in erythroid cells enhance the cells’tolerance to oxidative stress imposed by excessα-hemoglobin in pathological conditions.However,the potential intracellular modulation of AHSP expression itself in response to oxidative stress is still unknown.The present study examined the effect and molecular mechanism of STAT3,an oxidative regulator,on the expression of AHSP.AHSP expression increased in K562 cells upon cytokine IL-6-induced STAT3 activation and decreased in STAT3 knock-down K562 cells.Regulation of AHSP in oxidative circumstance was then examined inα-globin-overloaded K562 cells,and real-time PCR showed strengthened expression of both AHSP and STAT3.ChIP analysis showed binding of STAT3 to AHSP promoter and binding was significantly augmented with IL6 stimulation and uponα-globin overexpression.Dual luciferase reporter assays of the wildtype and mutated SB3 element,an IL-6RE site,in the AHSP promoter in K562 cells highlighted the direct regulatory effect of STAT3 on AHSP gene.Finally,direct binding of STAT3 to SB3 site of AHSP promoter was confirmed with EMSA assays.Our work reveals an adaptive AHSP regulation mediated by the redox-sensitive STAT3 signaling pathway,and provides clues to the therapeutic strategy for AHSP enhancement.     

基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体转染法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT-PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2-HS3及近侧元件在瞬时表达中对β-珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况.结果显示,3.2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β-启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无明显协同作用.     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β－珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT－PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素（Hm)对K562细胞中β－珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ－珠蛋白mRNA水平升高,其β－珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β珠蛋白基因的转换机制相关。     

人参总皂苷对K562细胞STAT3表达的影响

目的:研究人参总皂苷(TSPG)体外作用k562细胞后STAT3蛋白在细胞中的表达、分布情况和STAT3通路在K562细胞分化中的作用和相关机制.方法:TSPG(200μg/ml)体外作用K562细胞不同时间,采用免疫细胞化学法、ELISA法、Western blotting法、激光共聚焦法检测K562细胞中STAT3表达、分布情况.结果:6h胞浆内STAT3蛋白吸光度0.306±0.038,12h降为0.170±0.037,之后逐渐回升,胞核内变化趋势则相反;免疫细胞化学法显示TSPG作用细胞12h,胞浆内呈浅棕色,胞核内呈深棕色;Westernblotting法检测列STAT3与β-actin吸光度比值胞浆内12h最低,胞核内最高;共聚焦观察TSPG作用细胞12h,胞浆内绿色荧光标记减少,核内绿色荧光标记增多,与红色细胞核颜色叠加呈现橙色.结论:TSPG作用K562过程中,能诱导STAT3由浆向核内转移,提示TSPG可能在JAK-STAT信号转导通路中,对促进K562细胞向成熟方向分化发挥重要作用.     

基因座控制元件HS2、HS3对β—珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体杂法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT－PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2－HS3及近侧元件瞬时表达中对β－珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况。结果显示,3．2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β－启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无协同作用。     

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

人参总皂苷对人红白血病细胞株（K562）中STAT5表达的影响

旨在探讨人参总皂苷对K562细胞STAT5表达的影响.MTT法显示TSPG对K562细胞增殖抑制程度呈剂量与时间依赖性增加,且呈正相关关系.流式细胞术表明TSPG能阻止K562细胞从G0/G1期向S、G2/M期移行.激光共聚焦显微镜观察可见,TSPG 200 mg/L作用K562细胞24 h,胞浆中的STAT5荧光强度增加,而胞核内STAT5荧光强度减弱.Western blotting结果显示,TSPG作用K562细胞6 、24 、48 h,胞核中STAT5表达较对照组减少,TSPG作用72 h胞核蛋白中STAT5表达增加;TSPG作用K562细胞6 、12、24、48、72 h,胞浆内STAT5表达增加.TSPG能减少K562胞核中STAT5的表达,这可能是TSPG抑制K562细胞增殖的作用机制之一.     

IL-6/STAT3报告基因系统的构建及抑制IL-6/STAT3信号通路的中药单体的筛选及验证

寻找可抑制IL-6/STAT3信号通路的活化从而抑制肿瘤的生长和恶化的中药单体化合物具有重要意义及发展前景。文中通过基因重组技术构建出一种含有STAT3增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的新表达载体,并进一步建立受STAT3调控并稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系,利用该细胞系定量检测多种中药单体化合物对IL-6/STAT3信号通路的调控作用,并对抑制IL-6/STAT3信号通路的中药单体的效果进行验证。酶切鉴定及测序结果表明报告基因表达载体pQCXIP-STAT3-NLuc构建成功。STAT3转录因子的刺激物白细胞介素-6(IL-6)作用于所构建的稳定表达NLuc的细胞系后出现特异性荧光素酶反应,且作用效果呈良好的剂量依赖性,表明受STAT3调控稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系构建成功。Western blotting及Real-time PCR实验结果表明所筛选的中药单体化合物石斛碱及粉防己碱可抑制IL-6/STAT3信号通路并显著下调其下游基因Bcl-2及Bcl-x的表达,且作用呈剂量依赖性。综上所述,文中构建了可高效检测STAT3转录活性的报告基因系统,并利用该系统成功地筛选出可抑制IL-6/STAT3信号通路的中药单体化合物,具有一定的理论和应用价值。     

KLF1和KLF9对K562细胞红系分化的协同调控作用

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是锌指蛋白超家族的一个亚家族,参与细胞内的多种生理、病理过程,该家族成员在红细胞分化发育过程中发挥非常重要的作用,但是家族成员间对红系分化的协同调控作用还鲜有报道。本课题组前期研究发现,KIF家族成员KLF1和KLF9在已分化的红系细胞中的表达水平显著高于造血干细胞。为进一步探讨二者在红系分化中是否存在协同作用,本研究在K562细胞中分别过表达/敲低表达KLF1和KLF9,检测二者表达的相关性,发现KLF1和KLF9的基因表达呈现正相关,且二者共表达可以显著促进K562细胞红系分化,特异地增强β-珠蛋白的表达。通过对KLF1、KLF9单独和共同过表达、敲低表达的K562细胞转录组数据的分析发现二者可能通过PI3K-Akt和FoxO通路协同调控红系分化,FOS、TF、IL8是协同调控的候选靶基因。本研究结果为后续深入研究KLF1和KLF9协同调控红系分化的分子机制奠定了基础。     

PI3K/AKT信号通路调控Myogenin和MCK基因的表达

骨骼肌分化过程受多个信号通路调控, PI3K/AKT信号通路是其中最重要的信号转导通路之一。PI3K/AKT信号通路可以调控骨骼肌分化, 但在染色质水平上的调控机制还不是很清楚。文章以小鼠成肌细胞(C2C12)为研究材料, 采用免疫印迹、染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)、定量PCR (Q-PCR)的方法研究PI3K/AKT信号通路调控Myogenin和MCK基因的表达。研究发现, C2C12细胞分化过程中添加PI3K/AKT信号通路激活剂处理24 h, Myogenin和MCK蛋白表达水平显著升高, 组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX的表达也升高, H3K27me3在Myogenin基因启动子区和MCK基因启动子及增强子区的富集与对照组相比显著降低。用PI3K/AKT信号通路抑制剂处理, 结果相反。因此, PI3K/AKT信号通路可能通过调控组蛋白去甲基化酶UTX的表达活性改变靶基因的H3K27me3的富集进而调控骨骼肌分化。     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素(Hm)对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β-珠蛋白基因的转换机制相关。 Abstract: The recombinant plasmid HG was constructed,in which the reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was driven by the β-globin promoter and regulated under the HS2 element.The inductive effect of hemin on the expression of the β-globin gene and transiently transfected β-globin genes in K562 cells was analysed by FACS as well as RT-PCR method.The results showed that the level of γ and β-globin gene mRNA in K562 cells increased significantly after 24,48 and 72 hours induced with 30 μmol/LHm.And this inductive effect was sronger after 24 and 48 hours.Furthermore,the transient expression of plasmid HG in K562 cells increased significantly with hemin induction.These results indicated that the mechanism of inductive erythroid differentiation with hemin may be correlated with mechanism of γ→β-globin gene.     

当归多糖对K62细胞EpoR介导的信号转导通路研究

目的:研究当归多糖(APS)对K562细胞中EpoR介导的JAK2/STAT5信号转导通路的影响.方法:实验分为APS组(200mg/L APS)及阴性对照组(常规培养),两组细胞培养24h加入5×103IU/L Epo刺激,Western blot法检测Epo刺激不同时间后K562细胞核、浆蛋白中JAK2、STAT5的表达变化;免疫沉淀法检测其活性改变;采用免疫细胞化学技术和荧光显微镜观察其分布.结果:两组细胞培养24h加入Epo继续刺激对JAK2的表达影响不大,但APS组JAK2的活性较阴性对照组增强;Epo继续刺激K562细胞核中STAT5的表达及活性APS组都较阴性对照组增强.结论:APS在促进正常造血过程中,可能在EpoR介导的信号转导过程中增强JAK2、STAT5的酪氨酸磷酸化发挥重要作用.     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。     

当归多糖对K562细胞EpoR介导的信号转导通路研究

目的：研究当归多糖（APS）对K562细胞中EpoR介导的JAK2/STAT5信号转导通路的影响。方法：实验分为APS组（200mg/L APS）及阴性对照组（常规培养） ,两组细胞培养24h加入5×10^3IU/L Epo刺激,Western blot法检测Epo刺激不同时间后K562细胞核、浆蛋白中JAK2、STAT5的表达变化;免疫沉淀法检测其活性改变;采用免疫细胞化学技术和荧光显微镜观察其分布。结果：两组细胞培养24h加入Epo继续刺激对JAK2的表达影响不大,但APS组JAK2的活性较阴性对照组增强;Epo继续刺激K562细胞核中STAT5的表达及活性APS组都较阴性对照组增强。结论：APS在促进正常造血过程中,可能在EpoR介导的信号转导过程中增强JAK2、STAT5的酪氨酸磷酸化发挥重要作用。     

桃儿七联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的影响

该文探讨了桃儿七联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的影响。采用桃儿七、伊马替尼(imatinib, IM)单独和联合处理K562细胞, CCK8法和克隆形成实验检测药物对K562细胞生长抑制的影响;流式细胞术检测药物处理之后K562细胞周期的变化;间接免疫荧光法以及蛋白印迹法检测药物对BCR-ABL及其下游JAK/STAT信号通路相关分子的影响。结果显示,与桃儿七或IM单用相比,两药连用能更有效地抑制K562细胞的生长及克隆形成,能将K562细胞周期有效地阻滞在G2/M期。BCR-ABL融合蛋白及其下游STAT5信号通路分子表达及磷酸化水平明显减少。以上结果表明,桃儿七和低浓度IM联合处理具有协同效应,能有效地抑制K562细胞的增殖,其机制可能与细胞周期阻滞和BCR-ABL-JAK-STAT5信号通路抑制有关。     

X射线对A549细胞DNA的损伤可能与JAK/STAT信号通路的激活有关

本研究旨在观察不同剂量X射线对A549细胞DNA的损伤和JAK/STAT信号通路激活水平之间的关系。分别用2、4、8Gy X射线对A549细胞进行照射后,用CCK8法检测A549细胞增殖情况,用酶联免疫法检测照射后不同时间点培养液上清中白介素6 (interleukin 6, IL-6)的含量,用免疫荧光染色法检测细胞IL-6受体(IL-6 receptor, IL-6R)和p53结合蛋白1 (p53 binding protein 1, 53BP1)的蛋白表达情况,用Western blot检测细胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表达水平。结果显示,和对照组相比,X射线照射可降低细胞增殖水平,上调53BP1表达,提高细胞培养液上清中IL-6含量,并上调IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表达水平。X射线照射的上述作用存在一定的剂量依赖性。以上结果提示,X射线造成细胞DNA损伤的机制可能与JAK/STAT信号通路的激活有关。     

OxyR介导的细菌氧化胁迫应答调控机制研究进展

OxyR属于LysR型转录因子家族的氧化胁迫调控蛋白,是细菌抵抗氧化胁迫压力的重要调控因子。OxyR能够通过调控过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化基因的表达清除H₂O₂、参与铁代谢控制胞内过氧化物的产生以及修复生物大分子氧化损伤,从而抵抗氧化胁迫。OxyR的基因表达调控功能依赖于其还原态和氧化态之间的转变,改变调控蛋白对下游基因调控区的亲和能力。氧化态OxyR识别启动子区的结合序列,激活或抑制过氧化氢酶等基因的表达。还原态和氧化态的转换依赖于在氧化状态下分子间二硫键的形成。本文综述了近年来细菌OxyR调控基因表达的最新研究进展,有助于深入理解OxyR在细菌抵抗氧化胁迫的作用方式,为相关致病菌的防治奠定分子基础。     

沙眼衣原体持续感染对Hela细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响

目的：分析沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）持续感染对靶细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响.方法：利用Hela细胞分别建立Ct急性感染及持续性感染模型,通过qRT-PCR、ELISA等方法比较Ct感染过程中靶细胞TLR4、STAT3、IL-6转录水平及细胞因子IL-6分泌量的变化.结果：Ct感染后靶细胞TLR4、IL-6、STAT3转录水平及细胞因子IL-6分泌量均呈现时间相关性上调,且持续性感染状态下比急性感染状态下的上调更为显著;IL-6/STAT3的表达量与TLR4转录水平正相关.结论：Ct持续感染过程中TLR4 的持续活化可大幅上调IL-6/STAT3信号通路表达,可能参与了Ct持续感染后慢性炎性损伤过程.