黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌｉｔｕｒａ　　ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ,　ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｉｒｕｓ,ＰＤＶ）,以此病毒粒子作抗原,免疫家兔获得抗血清;用ＳＤＳ裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ）,利用抗ＰＶＤ抗血清对病毒受体进行检测,结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中４０ｋＤ、７３ｋＤ、８５ｋＤ的三种蛋白能够结合ＰＤＶ。     

犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定

犬瘟热病毒（ＣＤＶ）敏感细胞Ｖｅｒｏ用ＳＤＳ或ＲＩＰＡ溶解缓冲液溶解,利用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ）鉴定犬瘟热病毒疫苗株（ＣＤＶ－ｏｎｄｅｓｔｅｐｏｏｒｔ）的细胞受体。结果发现,在Ｖｅｒｏ细胞上有两组ＣＤＶ结合蛋白质,即高分子量组蛋白质（１２７ｋＤ、１２０ｋＤ、１１０ｋＤ）与低分子量组蛋白质（２７ｋＤ和３０ｋＤ）。这些ＣＤＶ结合蛋白组分的性质及在ＣＤＶ致病中的作用有等进一步研究。     

鸡减蛋综合征病毒（EDSV）主要蛋白的结构分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国株ＡＡ－２基因组全长为３２８３８ｂｐ,其编码病毒主要结构蛋白（５２／５５Ｋ、Ⅲａ、五邻体、ｐⅦ、ｐⅥ、六邻体、１００ｋ、ｐⅧ以及纤维蛋白等）的基因依次排列在基因组的中部,Ｅ２区编码ＤＮＡ结合蛋白、ＤＮＡ多聚酶、末端前体蛋白及ＩＶａⅡ的基因也分别排列在ＥＤＳＶ基因的负链上。对这些蛋白的氨基酸序列进行同源性比较后发现,ＥＤＳＶ的主要蛋白与羊腺病毒（ＯＡＶ）同类物存在不同     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Ｙ病毒普通系（ＰＶＹ０）的外壳蛋白基因克隆到表达质粒ｐＭＡＬｃ２中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体ｐＭＡＬｃ２ＰＶＹ０ＣＰ。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明,这一表达栽体在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中经ＩＰＴＧ诱导可表达分子量为７１．８ｋＤａ的特异性融合蛋白。以ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为１∶１０２４的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对ＰＶＹ进行检测     

A组轮状病毒我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－ 聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ） 获得了轮状病毒地方株 Ｔ１１４ Ｖ Ｐ６ 全基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,将其克隆入转移载体质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ 中,构建成重组质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ － Ｖ Ｐ６ 。对克隆的 Ｖ Ｐ６ 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒（ Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ） 野毒株 Ｄ Ｎ Ａ 共转染 Ｓｆ９ 细胞,筛选纯化得到含 Ｖ Ｐ６ 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 的检测。测序结果显示 Ｖ Ｐ６ 基因全长１ ３５６ｂｐ ,序列分析显示与 Ｗａ 株非常接近,提示 Ｔ１１４ 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约４５ｋ Ｄ 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约１２０ｋ Ｄ 的条带,提示重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 Ｖ Ｐ６ 的三体结构。     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白的转基因烟草的抗病性研究

将马铃薯Ｙ病毒中国分离物（ＰＶＴ－Ｃ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因,在土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４的介导下,转化烟草生产品种ＮＣ８９,获得了６个烟草株系。通过抗性分析发现,６个株系中有一个株系在２００μｇ／ｍｌＰＶＹ－Ｃ的攻毒下,仍未发病,分子检测发现,转基因植物中抗性产生的程度并不是同ＰＶＹ－Ｃ外壳蛋白的表达水平成正相关。     

从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组II分离物

在对云南省烟草病毒病的研究中,分离到一种直径约26～30nm的球形病毒。提纯病毒进行的SDSPAGE发现一条55kD蛋白带。55kD蛋白N端10个氨基酸与CMV亚组II的Q株系外壳蛋白N端氨基酸同源性为100%。以CMVQ抗血清对55kD蛋白进行了Western blot检测,发现55kD蛋白与CMV Q株系抗血清有血清学反应。根据已报道的CMV亚组II外壳蛋白基因序列合成引物,采用RTPCR技术扩增到一条约09kb的cDNA条带,并进行了克隆及序列测定,经Genbank比较,发现此09kb cDNA包含一657bp的外壳蛋白基因,其核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与CMV亚组II分离物有极高的同源性,分别达97%～98%和96%～99%,而与亚组I分离物的同源性仅为75%～76%和78%～79%。因此,该球形病毒应为CMV亚组II的一个分离物,命名为CMVYnb。     

马铃薯无病毒苗的获得与病毒检测

马铃薯无病毒苗的获得与病毒检测李宪章李明福侯林林（中国科学院植物研究所,北京１０００９３）ＡＣＱＵＩＲＥＭＥＮＴＯＦＰＯＴＡＴＯＶＩＲＵＳ－ＦＲＥＥＰＬＡＮＴＬＥＴＡＮＤＶＩＲＵＳＤＥＴＥＣＴＩＯＮＬｉＸｉａｎ－ｚｈａｎｇＬｉＭｉｎｇ－ｆｕＨｏｕＬ...     

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶还原酶组分的纯化和性质

Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）粗酶提取液经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和ＤＥＡＥ－ＴＳＫｇｅｌＨＰＬＣ分离纯化出ＭＭＯ还原酶组分．经ＨＰＬＣ分析,纯度大于９５％,纯化倍数为４．４,加入至ＭＭＯ羟基化酶和调节蛋白Ｂ的体系中表现比活为２２８ｎｍｏｌ环氧丙烷每分钟毫克蛋白．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明还原酶由一种亚基组成,分子量４２ｋＤ．ＩＣＰ－ＡＥＳ测定还原酶的Ｆｅ含量为１．８３ｍｏｌＦｅ每ｍｏｌ蛋白．ＵＶ－Ｖｉｓ光谱表明还原酶除２８０ｎｍ蛋白质特征峰外在４６０ｎｍ有最大吸收峰,且Ａ２８０ｎｍ／Ａ４６０ｎｍ为２．５０,与其它黄素一铁硫蛋白相似,推测还原酶可能含一个ＦＡＤ辅基和Ｆｅ２Ｓ２中心．在厌氧条件下,还原酶能够和ＮＡＤＨ作用,ＵＶ－Ｖｉｓ光谱分析表明还原酶４６０ｎｍ处特征吸收峰消失,说明在ＭＭＯ催化过程中还原酶接受ＮＡＤＨ的电子．ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析分离出调节蛋白Ｂ,部分纯化的调节蛋白Ｂ的分子量大约在２０ｋＤ,它能够提高ＭＭＯ比活性４０倍,ＭＭＯ还原酶和调节蛋白Ｂ单独存在时不具有ＭＭＯ     

马铃薯卷叶病毒中国株（PLRV-Ch）ORF2a基因特征分析

马铃薯卷叶病毒 (ＰＬＲＶ)是正链ＲＮＡ病毒 ,属黄化病毒组[1 ] 严格虫传 ,分布广泛 ,难以控制 ,侵染马铃薯 ,给生产造成巨大损失。ＰＬＲＶ基因全长 6 0ｋｂ ,有 6个读码框架 ,其中ＯＲＦ2ａ是第二读框 ,全长 192 0ｂｐ ,编码一个 70ｋＤ的多肽。另外 ,ＯＲＦ2ａ在与ＯＲＦ2ｂ重叠处可发生移码继续转译 ,直到ＯＲＦ2ｂ的尾 ,转译产物为一条 118ｋＤ的多肽 ,该蛋白的Ｃ端与复制酶的序列具很大的同源性[2～ 4] 。Ｐｒｕｆｅｒ[5] 等和Ｋｕｊａｗａ[6] 等分别研究了ＰＬＲＶ基因组上ＯＲＦ2ａ与ＯＲＦ2ｂ重叠区附近与移码有关的滑动序列及其…     

东亚三角涡虫Rab蛋白cDNA序列的克隆与生物信息学分析

通过构建东亚三角涡虫(Dujesia japonica)cDNA文库,随机挑选重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得1个三角涡虫新基因——Rab蛋白基因(DjR),涡虫Rab蛋白cDNA全长2 141 bp,开放性阅读框(ORF)621bp,编码206个氨基酸,相对分子量为23.1 kD,等电点6.59,属亲水性蛋白,主要定位于细胞质中,在氨基酸第20和21位之间有信号肽剪切位点。有8个磷酸化位点。含有小G蛋白家族5个保守的鸟苷酸结合区域。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他23个物种的相似性为53%-90%,且符合种属之间的进化关系。     

桑泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的:利用3’RACE技术克隆植物泛素基因,是进一步研究其功能的基础。方法:本研究从桑树(丰驰桑)(Morus bomby-cis)幼叶中提取总RNA,反转录成cDNA,根据已报道的泛素基因序列设计1条正向引物,利用3’RACE(Rapid Amplification of cDNAEnd)技术进行扩增。结果:扩增出1条690 bp的泛素基因片段。该片段5’端为编码156个氨基酸残基的阅读框,3’末端有219bp的非翻译区。结论:同源分析表明,此cDNA序列为泛素延伸蛋白基因(Genebank登录号为DQ839403)。用Genedoc软件对该片段编码的氨基酸序列进行同源性分析的结果表明:桑树泛素延伸蛋白与马铃薯、烟草、陆地棉、黄瓜的泛素延伸蛋白以及苜蓿的核糖体S27A蛋白的同源性都在96%以上。     

cDNA cloning and characterization of the novel genes related to aldehyde dehydrogenase from wild Chinese grape (Vitis pseudoreticulata W. T. Wang).

mRNA differential display was employed to study the gene differential expression of wild Chinese grape (Vitis pseudoreticulata W. T. Wang) infected by Uncinula necator in different periods, a cDNA fragment of T11AC/B0319-456 coded by aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene has been obtained. 5' RACE and 3' RACE have been used to clone the whole cDNA sequences of ALDH which consists of three cDNA sequences, whose sizes are 1887, 1956 and 1961 bp, and they encoded a polypeptide size of 537, 524 and 477 designated as VpALDH2a, VpALDH2b and VpALDH1a, respectively. The deduced amino acid sequence shared highly identity with other plants and Human ALDH. Both VpALDH2a and VpALDH2b protein contain putative mitochondrial targeting sequence except VpALDH1a, it indicates that VpALDH2a and VpALDH2b are mitochondrial enzymes, and VpALDH1a is cytosolic enzyme. The VpALDH2a was subcloned into the expression vector pGEX-4T-1, transformed into E.coli BL 21-coden plus induced by IPTG, and about Mr. 85 kD of GST-ALDH fusion protein displayed in SDS-PAGE gel.     

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)诱导的水稻早期反应基因ER1的5' 端cDNA片段克隆及序列分析

研究高等生物基因表达与调控的一个重要方面是分离基因的编码区及其上游的调控序列（ＤｅＶｅｅｒ等１９９７）,这需要获得一个基因的ｃＤＮＡ全长及从植物基因组获取全基因。在前文（周建明等１９９９）中曾经分离了稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因ＥＲ１的ｃＤＮＡ片段,但是运用ｍＲＮＡ差异显示技术分离的ｃＤＮＡ片段往往只有近ｍＲＮＡ３’端的一部分,难以反映基因的结构及功能特点,因此,必须进一步分离其５’端的部分才有可能比较全面地了解此基因的特点。ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎ…     

球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_327967)和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianu,P35143)的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3_phosphatedehydrogenase,GAPDH)氨基酸序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌丝ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌GAPDH全长cDNA序列。该序列长1240bp,开放阅读框1014bp,编码337个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为36.1kD。用PCR方法克隆了该基因的DNA序列,序列长为1556bp,由2个内含子和3个外显子组成。BlastP同源性分析表明该基因与鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)同源性最高为95%;与米曲霉(Aspergillusoryzae)同源性最低为87%。GAPDH酵母转化子生物功能分析表明转化子对Na2CO3和高温有高的耐受性,证明GAPDH为抗胁迫基因。该基因的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY522719,AY593253,AAS01412)。     

金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).