多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氯酸转移核糖核酸3’端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpΨFpG的合成。先以Cpm~1pΨ为引物,GDP 为底物,在PNPase 和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1lpΨpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpΨpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpΨpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~1Ip-N 键。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端(36～45)CP~(m~1)IpψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的合成

本文报道利用T_4 RNA连接酶酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端(36～45)Cp~(m~1)Ip-ψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的工作。合成制备时,我们采用将Cp~(m~1)IpψpG、GpG、ApGpApGp三片段从5′向3′延伸的合成路线。在合成路线的探索中我们发现了一些新现象:1.在T_4 RNA连接酶催化反应中Cp~(m~1)Ipψ作为受体有局限性。2.GpG等二核苷一磷酸可以与pCp等供体分子连接。3.60℃预温育对GpG片段的标记和六核苷酸、十核苷酸连接反应提高产率有明显的作用。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸中十三核苷酸(23～35)类似物(CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIpGp)的合成

本文报道了利用酶促合成的方法(RNase N_1和T_4 RNA连接酶)合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中第23位到第35位的十三核苷酸的类似物CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIp-Gp(天然酵母丙氨酸tRNA中第26位是m_2~2G)。CpGpCpG是由CpG>p和CpG经RNase N_1酶催化合成的,产率为20%。十三核苷酸CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成是由T_4 RNA连接酶催化CpGpCpG与pCpUpCpCpCpUpUpIpGp之间的连接反应实现的,产率为80%。产物经双向电泳层析分析为一点,用蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的双向图谱分析证明十三核苷酸的核苷酸排列顺序正确。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA的切点在反密码子的G—C键之间。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA 的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA 与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA 的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA 的切点在反密码子的G—C 键之间。     

核糖核酸結构的研究 Ⅲ.利用核糖核酸酶T_1研究絲腺与酵母可溶性核糖核酸的結构

(1) 从高峰淀粉酶制剂(Taka-Diastase)制得RNase T_1,提纯了2800倍,可用于结构研究,从上海四万酿造厂的米麯也分得类似纯度、类似特异性的酶。(2) 用RNase T_1单独或与RNaseⅠ联合作用的结果,均发现啤酒酵母与蓖麻蚕絲腺腺体sRNA的结构有显著差异。例如用RNase T_1单独作用时,由蓖麻蚕蒜腺sRNA所得Gp大于啤酒酵母sRNA,而UpUpGp则小于后者。用两个酶联合作用时,由蓖麻蚕絲腺sRNA所得Cp、(Gp+Gp!)大于啤酒酵母sRNA,且前者较后者多出许多含稀有成份的紫外光吸收点,其电泳层析行为及表现熒光性质较为特殊。(3) 蓖麻蚕蒜腺sRNA合有-Gp(Ap)_4Cp-及-Gp(Ap)_3Cp-等结构。(4) RNase Ⅰ与RNase T_1联合水解sRNA所得Gp!/Gp值大于RNase T_1单独作用时所得Gp!/Gp值。     

2′—5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅰ.以2′-5′寡聚腺苷酸作为T_4-RNA连接酶的供体和受体合成其衍生物的方法

在干扰素的功能表达中,2′-5′寡聚腺苷酸是一类重要的媒介物。本文研究了T_4-RNA连接酶的专一性及其用于2′-5′寡聚腺苷酸衍生物合成的可能性。1980年,我们曾发现2′-5′寡聚腺苷酸可以作为RNA连接酶的受体。本文对此作了进一步的研究,证实了T_4-RNA连接酶可以将pNp(N=A,G,C,U)、pCpUpC、pCpm_2~2G等供体连到2′-5′P_3A_3受体上去,生成各种相应产物。2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸能否作为T_4-RNA连接酶的供体,有人估计不大可能。本文也证实了T_4-RNA连接酶能将供体pA~(2′)p~(5′)A连接到CpUpC、UpCpCpA、Cpm′IpψpG等受体上面去。从而说明T_4-RNA连接酶也可使用2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸作为供体。应用T_4-RNA连接酶,可以合成既含有2′-5′又含有3′-5′磷酸二酯键的寡核苷酸。本工作还证明A~(2′)p~(5′)A也可以作为T_4-多核苷酸激酶的底物。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2’-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2.7.7.26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端接受茎区八核苷七磷酸GpUpCpGpupCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNase N_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAESephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04MDTP,0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUpCpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2′-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2·7·7·26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNaseN_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAMSephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04M DTPJ 0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUp(UpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究——Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC:GDP=1:5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4:1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCpG>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究 Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC∶GDP=1∶5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4∶1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCp@>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究——Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(Me)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+ppψ~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm′Ipψ~(Me)),而UpCpC+ppψ~(Me)时,则有UpCpCpψ~(Me)的生成。GpCpm′I+ppψ时,有少量GpCpm′Ipψ合成。这些结果说明,在PNPase的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

多核苷酸合成的研究 Ⅹ.GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的合成

本文报导了GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的化学合成和酶促合成。同用DCC缩合并脱去3′-磷酸上的苯胺保护基后得到,后者再同缩合,然后脱去全部保护基经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化而得到GpCpm~1Ⅰ纯品。而同用DCC缩合并脱去全部保护基后可得到Cpm~1Ⅰ,然后在核糖核酸酶N_1作用下同pG>p联结并经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化则得到pGpCpm~1Ⅰ。GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ均经酶解后得到预期的核苷酸组成比例。     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

自1972年Silber等入首先从T_4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出RNA连接酶后,人们对分离纯化这种酶的工作进行了很大的改进。目前有些实验室已能制备较纯的T_4RNA连接酶,但方法比较繁琐,通常要经过六个层析牲才能得到较好的结果。甲此寻求一种简单有效的纯化方法是很有意义的。我们将免疫亲和层析用于T_4RNA连接酶的纯化,方法简便,同时所得到的酶测不到RNase的活性,可用于一定序列寡聚核糖核酸的合成。     

多核苷酸合成的研究 Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1Ipψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端半分子反密码区中的GpCpm~1IpΨ四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(Ho)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m~1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(iBu)G~(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm~1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1pψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区中的GpCp-m~1IpΨ*四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(HO)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m_1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(1Bu)G_(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm_1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

本文描述了一种新的、简化了的纯化T_4RNA连接酶的方法——免疫亲和层析法.利用这种纯化方法得到的酶,经SDS-凝胶电泳,得到一条主带。将此酶与~(32)pCp及CpGpGpA(或tRNA)一起进行连接反应,未见到RNase杂酶的降解作用。用此方法制备的酶,可用于确定顺序的核酸的合成。     

LATS对离体正常小鼠甲状腺合成和释放甲状腺激素的影响

本文研究了长效甲状腺刺激物(简称LATS)对离体正常小鼠甲状腺合成和释放甲状腺激素的影响。用配对实验法,将小鼠甲状腺两叶分别放入两个培养瓶内,一组加LATS-IgG,另一组加正常人IgG作对照,在其他条件相同的情况下,实验组的摄碘率、碘的有机化作用和甲状腺激素的合成,分别增加37.5%、85%和150%。在相同的培养条件下,大鼠甲状腺过氧化物酶(简称TPO)活性,实验组比对照组增高了约三倍。说明LATS可能通过促进摄碘和活化TPO酶,促进甲状腺激素的合成。用离体培养和放射免疫测定方法证明,每毫升培养液中加50μlLATS血清(McKenzie活性为4,000%),正常小鼠甲状腺释放T_4和T_3均可增加十多倍。如果先用~(125)Ⅰ体内标记2小时,再将甲状腺摘出体外培养,则LATS组不仅总的释放率增加,而且释放物的组成成分,也有所不同,激素碘占16.6%,无机碘占83.4%;而对照组分别为2.1%和97.9%。