Cmku70基因敲除对蛹虫草生长发育的影响

ku70和ku80是非同源末端连接修复通路的关键基因,在一些丝状真菌中其基因敲除株可作为底盘菌株,提高同源重组效率和基因敲除效率。本研究从蛹虫草基因组中鉴定得到Cmku70及Cmku80基因,分别编码分子量为71.50kDa和80.96kDa的蛋白,均含有Ku core结构域,预测均定位于细胞核。系统进化分析表明Ku70和Ku80蛋白在真菌中广泛存在,且具有保守性。通过农杆菌介导的同源重组法敲除Cmku70,发现不影响蛹虫草菌丝生长、见光转色、分生孢子形成及形态等无性生长过程,但敲除后不能形成子实体,因此Cmku70敲除株不宜用作蛹虫草生长发育相关基因高效敲除的底盘菌株。     

bZIP转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长发育和致病力

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要病害之一,引起该病害的主要致病菌为果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola。本研究以果生刺盘孢菌bZIP类转录因子CfHac1为研究对象,研究其在果生刺盘孢菌的营养生长、产孢量、附着胞形成、致病力及耐受性等方面的生物学功能,为油茶炭疽病的防控提供理论依据。研究结果表明,果生刺盘孢菌中具有一个与灰色大角间座壳（稻瘟菌）bZIP转录因子MoHac1直系同源的基因,命名为CfHAC1。该基因全长1 627bp,编码526个氨基酸,该蛋白含有一个碱性亮氨酸链（bZIP）结构域和3个未知功能结构域。CfHAC1基因敲除突变体的菌丝生长速度显著变慢,分生孢子产量显著减少且不能正常形成附着胞,并对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加;致病力测试结果表明,果生刺盘孢菌基因敲除突变体ΔCfhac1对油茶的致病力显著下降。转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长、产孢、附着胞的形成、致病力以及响应外界渗透压胁迫过程。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌。本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据。采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株ΔCfvps17。构建目的基因CfVPS17回补载体pYF11::CfVPS17,经转化获得ΔCfvps17-C回补菌株。测定野生型、突变体ΔCfvps17及回补菌株ΔCfvps17-C的生物学表型,结果表明,与野生型和回补菌株相比,突变体ΔCfvps17菌丝生长速率、产孢量和附着胞形成率显著降低,突变体菌丝中糖原积累减少,对氯化钠和刚果红胁迫耐受性增强;致病力测定结果表明,突变体ΔCfvps17丧失了对油茶叶片的致病力。液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢糖原积累、生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

组蛋白去乙酰化酶CfSnt2调控果生刺盘孢生长发育和致病力

炭疽病是油茶Camellia oleifera的重要病害,该病害的优势致病菌是刺盘孢属Colletotrichum的果生刺盘孢C. fructicola,在全国的油茶产区普遍发生。我们前期发现组蛋白乙酰转移酶CfGcn5调控油茶果生刺盘孢的生长发育和致病过程,但组蛋白去乙酰化酶在该病菌中的生物学功能尚不清楚。本研究以组蛋白去乙酰化酶CfSnt2为研究对象,利用反向遗传学的方法,通过对野生型、CfSNT2基因敲除突变体及互补菌株的生物学表型进行比较分析,发现CfSNT2基因敲除突变体的菌丝生长速率明显减缓、分生孢子的产量显著减少、附着胞形成率降低、对细胞壁胁迫剂的响应异常,同时对油茶致病力显著减弱。以上现象说明CfSnt2调控果生刺盘孢的生长、产孢、附着胞的形成、对细胞壁完整性胁迫剂的耐受性及致病力。     

自噬相关蛋白CfAtg8在果生刺盘孢中的功能分析

油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能尚不清楚。本研究根据同源重组的原理及PEG介导的原生质体转化方法,获得了CfATG8基因敲除突变体及其互补菌株。进一步通过生物学表型分析,发现突变体生长减慢、产孢量减少、附着胞形成率降低、对细胞壁完整性胁迫耐受性降低,并且丧失对油茶的致病性。上述结果表明,CfAtg8参与调控果生刺盘孢的营养生长、无性繁殖、附着胞形成、对外界胁迫应答及致病过程。     

CfAtg8在调控果生刺盘孢正负菌株分化中的功能

由果生刺盘孢Colletotrichum fructicola引起的炭疽叶枯病严重危害苹果果实和叶片。刺盘孢属真菌可以产生具有形态和遗传差异的正型(+)和负型(-)菌株,但其分化的分子机制目前尚不清楚。本研究通过同源重组对CfAtg8功能进行分析,结果显示,CfAtg8显著影响果生刺盘孢正菌株(1104-7)菌落颜色和气生菌丝茂密程度,但不影响负菌株(1104-6);正菌株突变体不产生子囊壳,负菌株突变体子囊壳变小、数量增多;正菌株突变体与负菌株野生型1104-6杂交不形成交配线,负菌株突变体与正菌株野生型1104-7杂交形成正常交配线;此外,CfAtg8还影响正、负菌株分生孢子萌发、附着胞形成及致病性等。这些结果表明自噬基因CfAtg8是影响果生刺盘孢正负菌株分化、形态发育和致病的重要基因。     

果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型C. fructicola菌株特异基因Cfcyp450。本研究对其功能进行分析,以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示,Cfcyp450敲除突变体与野生型生长速率无明显差别,但敲除突变体菌落变白;与野生型相比,突变体附着胞形成降低30.02%;侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降41.19%。致病性测定显示,突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示,Cfcyp450仅存在于叶枯型菌株中,同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高,但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢Cfcyp450基因为叶枯型菌株的关键致病因子,可能通过水平转移获得。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

CfNop12参与调控果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要致病菌。研究果生刺盘孢RNA结合蛋白基因CfNOP12的生物学功能,阐述果生刺盘孢致病的分子机制,为油茶炭疽病的防治提供理论基础。根据同源重组原理,在果生刺盘孢中敲除目标基因CfNOP12,PCR验证获得正确的突变体ΔCfnop12;进一步构建PYF11::CfNOP12回补质粒,导入突变体原生质体中,筛选成功互补菌株ΔCfnop12-C。对这些菌株进行生物学表型测定,发现突变体ΔCfnop12营养生长速率显著下降,分生孢子的产量及附着胞形成率显著降低;在含有细胞壁胁迫剂的PDA培养基上,突变体ΔCfnop12的抑制率相较于野生型和回补菌株显著升高,在低温条件下,突变体的生长速率表现出明显下降;野生型和回补菌株几丁质聚集在菌丝顶端,突变体ΔCfnop12尖端几丁质分布不正常;相比于野生型和回补菌株,突变体致病力显著降低。综上所述,潜在RNA结合蛋白基因CfNOP12参与调控了果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力。     

甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化DNA双片段的基因敲除方法的建立

由甘蔗鞭孢堆黑粉菌Sporisorium scitamineum引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产的主要病害,严重影响了甘蔗的产量和品质,然而其分子致病机制报道很少,极大地影响了有效防控技术的开发。为了提高该病菌基因功能的研究效率,本研究以甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合两个关键基因SsGPA3和SsPRF1为目标,建立了基于DNA双片段的甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化基因敲除技术体系。结果表明甘蔗鞭孢堆黑粉菌单倍体细胞生长期在OD₆₀₀约为0.7,28℃下10mg/mL细胞壁裂解酶作用30min获得的原生质体产率最高,再生率最优;使用线性DNA双片段转化获得阳性转化子的成功率达90%以上,显著高于线性DNA单片段和质粒。本方法的建立将极大地提高甘蔗鞭孢堆黑粉菌的基因敲除效率,同时也为其他真菌的基因敲除提供借鉴。     

基于CRISPR/Cas9的蛹虫草无抗性标记转化技术的构建

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5^-中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5^-为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。     

大把子杯桩菇：产自山西的一个新物种

基于多基因片段的系统发育分析显示,山西省吕梁山区俗称为大把子的一种传统野生食用蘑菇是隶属于假杯伞科Pseudoclitocybaceae杯桩菇属Clitopaxillus的一个分类学新物种,本研究将其定名为大把子杯桩菇C. dabazi。该种与分布于欧洲的C. alexandri和C. fibulatus形态特征相似并且有密切的亲缘关系。大把子杯桩菇的鉴别特征为菌盖半球形,菌盖边缘稍内卷,土黄褐色至灰白褐色,菌柄粗棒状,具蘑菇香味。大把子杯桩菇在秋季发生,在整个吕梁山脉均有分布,在中北部的管涔山、关帝山区域,主要生长于云杉Picea sp.、落叶松Larix sp.林内的草地上;而在南部的五鹿山一带,则发生于松Pinus sp.、栎Quercus spp.混交林内草地上。本文还提供了杯桩菇属已知3个物种的分种检索表。     

深海白色侧齿霉遗传转化体系建立及渗透压调控相关的EaSHO1基因功能

海洋中具有丰富的动植物及微生物资源,海洋真菌是其重要组成之一.我们前期的研究发现一株深海真菌白色侧齿霉Engyodontium album能产生具有抑菌活性的次级代谢产物engyodontiuminA,该化合物能抑制黑曲霉、金黄色葡萄球菌及创伤弧菌等病原菌的生长,是一种潜在的海洋源抗菌药物.目前,该菌遗传转化体系尚未建...     

互补交配型配对诱导蛹虫草有性子实体形成

前期我们获得了优良性状蛹虫草Cordyceps militaris野生菌株W141436,其子实体虫草素含量高达3.72 mg/kg干重,子实体多糖高达6.7 g/100 g干重,但在大规模应用中发现它发生退化。针对蛹虫草人工栽培退化问题,我们提出蛹虫草子实体形成是有性生殖过程,其两种交配型发生交配是蛹虫草子实体形成的必要条件。本文基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌株W141436的退化机制。具体地,采用单孢子分离的方法对蛹虫草野生分离株W141436的子囊孢子进行分离,得到了72个单孢菌株。进一步采用PCR方法对单孢菌株及亲本菌株进行了交配型基因类型鉴定。在72个单孢菌株中,28株为Mat1-1类型交配基因型,31株为Mat1-2类型交配基因型,13株含有与亲本相同的交配型基因。根据鉴定结果,对2株Mat1-1型(SP28、SP33)和2株Mat1-2型(SP15、SP32)菌株进行了栽培实验。结果表明,形成子实体的栽培用亲本菌株同时含有Mat1-1和Mat1-2两种交配类型基因,即只有含不同交配型基因的菌株具有发育为子实体的能力,而含同种交配型基因的菌株则不能发育为子实体。本研究为防止蛹虫草在大规模种植中退化提供了理论依据。     

希木龙念珠菌研究进展

希木龙念珠菌Candida haemulonii是一种与耳念珠菌亲缘关系十分相近的物种。近年来,由其引发的侵袭性真菌疾病的发病率不断升高。作为一种多重耐药真菌,希木龙念珠菌对常见抗真菌药物的耐药性甚至超过耳念珠菌。体外药敏试验证实大部分希木龙念珠菌菌株对唑类、多烯类以及棘白菌素类等抗真菌药物耐药,尤其是对两性霉素B具有天然抗性。不仅如此,临床传统的生化方法难以对该菌准确鉴定,常用的商品化鉴定产品往往将其错误鉴定为毕赤酵母或者新型隐球菌。为了进一步加深对希木龙念珠菌的认识,本文结合国内外的流行病学数据与研究进展,从感染现状、生物学特征、耐药性进行综述,同时总结该菌目前诊断、治疗和预防措施。     

点滴复膜酵母兔源分离株基因组测序及比较分析

点滴复膜酵母Cyniclomyces guttulatus是一种定殖及生长于犬、兔、豚鼠、龙猫、大鼠和小鼠等动物胃肠道内的真菌。与大多数传统酵母相比,点滴复膜酵母具有耐酸(pH 1.5-4.5)、耐高温(38-42 ℃)的独特生长特性,可在体外快速增殖。腹泻动物粪便中可见大量点滴复膜酵母,尽管没有直接证据表明感染点滴复膜酵母会引起明显病状,但其被认为是多种动物的机会性致病菌。本研究通过全基因组测序和转录组测序明确点滴复膜酵母的基因结构和注释信息,获得点滴复膜酵母的系统性基因组和转录组数据。结果显示基因组大小为29.71 Mb,包含11 307个基因,转录组大小为17.67 Mb,GC含量分别为43.02%和43.09%;mRNA、CDS、外显子和内含子的平均长度分别为1 476、1 447、1 374和540 bp;点滴复膜酵母存在517个独特的基因家族,共包括1 162个基因,该酵母的独特基因特点为后续研究奠定基础。比较分析结果表明,点滴复膜酵母的基因组大小和数量明显大于其他12种酵母,提示该酵母可能存在全基因组复制,这可能与其独特的胃肠道定殖、耐酸和耐高温生长特性密切相关。     

陆地棉GST基因家族全基因组分析

谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST)是一种普遍存在的具有多功能的超家族蛋白,在植物初次生代谢、逆境胁迫、胞间信号传递等方面具有重要作用;同时,作为配体其在植物激素代谢以及物质转运方面也发挥作用。为了解析陆地棉(Gossypium hirsutum L.) GST基因家族的信息,本研究对该基因家族成员的种类、进化关系、物理定位、基因结构和保守基序以及表达模式进行了分析。结果显示,在陆地棉全基因组中共含有70个GST基因,进化树和基因结构分析将该家族分为U族、F族、T族、Z族、EF1Bγ族和TCHQD族。基因定位分析发现,除了AD/At2、AD/At4、AD/At5、AD/Dt5、AD/Dt10号染色体上没有GST基因外,其他染色体上都有GST基因,并且在AD/At9、AD/Dt7、AD/Dt12、AD/Dt13这4条染色体上出现基因簇。对F族(Phi类) 9个GST基因进行荧光定量分析,结果表明,除GhGSTF1可能为假基因外,GhGSTF2~9等8个基因在陆地棉根、茎、叶以及各个发育时期的纤维中均有表达;结合生物信息学分析,推测GhGSTF8可能参与原花青素/花青素的转运和积累;GhGSTF4、GhGSTF6和GhGSTF9可能在调节陆地棉的生长和胁迫反应中起作用,而GhGSTF2、GhGSTF3、GhGSTF5和GhGSTF7的功能还有待进一步研究。本研究为陆地棉GST基因家族的分子进化及功能研究提供了理论依据。