膜片钳技术在动脉粥样硬化研究中的应用

膜片钳技术是一种先进的电生理技术,在生命科学研究中已得到了广泛的应用.最近几年已把它运用于研究动脉粥样硬化血管平滑肌细胞离子通道电生理特性的改变.研究发现血管平滑肌细胞的凋亡与K+通道活动增加有关,在动脉粥样硬化发生与发展过程中大电导型钙激活钾通道起着重要的功能作用.某些药物影响动脉粥样硬化血管平滑肌细胞离子通道而发挥作用.膜片钳技术给动脉粥样硬化发病机理研究带来了新的亮点.     

大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理检测

目的：研究大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理特性。方法：膜片钳全细胞和膜内向外记录模式检测大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活氯通道全细胞电流和单通道电流。结果：大鼠肺动脉平滑肌细胞记录到稳定的钙激活氯通道电流（ICl（Ca））;ICl（Ca）表现出典型的外向整流特性和电压时间依赖性激活。结论：大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上存在电压、时间依赖性氯通道电流,钙激活氯通道通过促进肺动脉平滑肌细胞去极化而成为调节肺动脉特性的关键调节因子。     

膜片钳技术的新进展及其在药物高通量筛选中的应用

作为先进的细胞电生理技术,膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明,以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的针对离子通道为靶标的药物研发的瓶颈,近年来,对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的需求,由此产生了一些新的技术。本文就最近几年膜片钳技术的新进展及其在药物高通量筛选中的应用进行了综述。     

钙激活性氯离子通道的电生理研究

目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道的电流、电压电流关系等电生理特性.方法:采用急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)分离出单个肺动脉平滑肌细胞,应用膜片钳技术,测定各组大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道电流和电压电流.结果:急性酶分离法能成功分离出适用于膜片钳记录的单个大鼠肺动脉平滑肌细胞,并测到稳定的钙激活性氯离子通道电流,该电流表现出时间、电压及钙离子依赖性,并呈外向整流特征.结论:大鼠肺动脉平滑肌细胞的钙激活氯离子通道具有时间依赖性、钙离子依赖性和电压依赖性,并具有外向整流特征.     

海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术

本文较为详细地介绍了海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术,对其关键步骤和需要注意的问题进行了重点说明,同时对CA1区锥体神经元突触活动的特点,电压门控性Ca^2 通道以及谷氨酸（glutamate,Glu)γ－氨基丁酸（GABA）受体通道电流性质等进行了观察和分析,实验结果为采用海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术研究海马神经元离子通道动力学性质和中枢神经系统药物对突触活动的影响提供了可靠的依据。     

美洲大蠊中枢DUM神经元的分离和电压门控Na+电流的记录

【目的】建立美洲大蠊Periplaneta americana中枢神经系统背侧不成对中间神经元（dorsal unpaired median neurons, DUM neurons）的分离方法和DUM神经元电生理实验模型。【方法】IA型胶原酶法消化美洲大蠊末端腹神经节, 机械吹打得到DUM神经元细胞, 运用膜片钳技术记录DUM神经元细胞电压门控Na+电流。【结果】分离得到的DUM神经元细胞状态良好, 具有DUN神经元典型的梨状形态和表面特征。以膜片钳全细胞方式记录到的Na+电流符合钠通道电流特征。【结论】IA型胶原酶消化得到美洲大蠊DUM神经元细胞的方法可靠, 能稳定地记录到Na+电流。本文描述的方法为昆虫神经细胞的电生理机制研究提供一个可用的实验模型。     

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。     

心房肌胞内钙浓度变化对心房颤动患者小电导钙激活钾通道电流的影响

目的：SK通道存在于心肌细胞上,其中SK2亚型主要表达在心房。SK2通道对胞内游离钙离子高度敏感,可快速将钙离子浓度的变化转换成细胞膜电位变化。本实验应用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞SK2电流,观察心房肌细胞SK2电流在窦性患者和心房颤动患者之间的差别,以及电极液中不同的钙浓度对两组细胞SK2电流的影响。方法：将接受体外循环手术的患者分为两组：心房颤动组和窦性心律组。以心房肌细胞为研究对象,用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞电流,观察窦性组与房颤组SK2通道电流的差异以及两组细胞SK2电流对电极液中钙敏感性的不同。结果：在全细胞穿孔膜片钳模式下,电极液中游离钙离子浓度为5×10-7mol/L时,记录到房颤组SK2通道电流明显大于窦性组,尤其是在超极化水平。膜电位在-130 mV时,窦性组与房颤组的SK2通道电流密度分别为（-2.92±0.35）pA/pF（n=6）,（-6.83±0.19）pA/pF（n=3,P〈0.05）。在电极液游离钙离子浓度分别为0 mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L,膜电位为-130 mV时,窦性组SK2通道电流密度分别为（-1.43±0.33）pA/pF（n=7）,（-2.92±0.35）pA/pF（n=6）,（-10.11±2.15）pA/pF（n=8,P〈0.05）;房颤组SK2通道电流密度分别为（-2.17±0.40）pA/pF（n=4）（-6.83±0.19）pA/pF（n=3）（-14.47±2.89）pA/pF（n=4）（P〈0.05）。结论：人心房肌细胞SK2通道具有电压不敏感、内向整流、apamin敏感的特性。电极液中钙浓度相同的情况下,房颤组的SK2电流密度明显大于窦性组,SK2通道电流对钙离子的敏感性高于窦性组,提示SK2通道钙敏感性增加可能与心房颤动的发生发展密切相关。     

小檗碱激活人结肠癌细胞容积敏感的氯通道

本文旨在研究小檗碱对人结肠癌细胞(SW480)氯通道的作用.采用膜片钳技术记录小檗碱激活的SW480全细胞氯电流,并用高渗和低渗灌流液、以及氯通道阻断剂研究该电流的生理学和药理学特性.结果显示,当细胞处在等渗液中,可在SW480细胞膜上记录到微弱且稳定的背景电流;小檗碱(10 nmol/L)可诱发SW480细胞迅速产生...     

Neuritin诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的电生理研究

目的:探讨神经营养因子Neuritin诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的电生理特性.方法:应用膜片钳技术,采用全细胞记录方式,对由Neuritin诱导的大鼠骨髓基质细胞进行诱导前后的电生理功能测定.结果:分化后的神经元样细胞较诱导前细胞的膜特性[静息膜电位(RMP)膜电容(Cm)串联电阻值(RS)]有了显著改变(p＜0.01).分化后细胞记录到K+电流,包括两种成分:外向延迟整流K+电流和内向整流K+电流.结论:骨髓基质细胞经过Neuritin诱导能够向功能性神经元方向分化.     

神经干细胞/前体细胞分化的功能学鉴定研究进展

神经干细胞／前体细胞分化是神经生物学研究的热点．以往对神经干细胞／前体细胞分化水平的鉴定主要依赖于形态学指标,而随着膜片钳技术的应用,神经干细胞／前体细胞分化过程中膜电特性的改变、离子通道活动等功能学指标越来越受到重视．综述了利用膜片钳技术研究神经干细胞／前体细胞功能分化的最新进展,并对存在的问题做出思考和展望．     

A novel silicon patch‐clamp chip permits high‐fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons

We report on a simple and high‐yield manufacturing process for silicon planar patch‐clamp chips, which allow low capacitance and series resistance from individually identified cultured neurons. Apertures are etched in a high‐quality silicon nitride film on a silicon wafer; wells are opened on the backside of the wafer by wet etching and passivated by a thick deposited silicon dioxide film to reduce the capacitance of the chip and to facilitate the formation of a high‐impedance cell to aperture seal. The chip surface is suitable for culture of neurons over a small orifice in the substrate with minimal leak current. Collectively, these features enable high‐fidelity electrophysiological recording of transmembrane currents resulting from ion channel activity in cultured neurons. Using cultured Lymnaea neurons we demonstrate whole‐cell current recordings obtained from a voltage‐clamp stimulation protocol, and in current‐clamp mode we report action potentials stimulated by membrane depolarization steps. Despite the relatively large size of these neurons, good temporal and spatial control of cell membrane voltage was evident. To our knowledge this is the first report of recording of ion channel activity and action potentials from neurons cultured directly on a planar patch‐clamp chip. This interrogation platform has enormous potential as a novel tool to readily provide high‐information content during pharmaceutical assays to investigate in vitro models of disease, as well as neuronal physiology and synaptic plasticity. Biotechnol. Bioeng. 2010;107:593–600. © 2010 Wiley Periodicals, Inc.     

USING ATOMIC FORCE MICROSCOPY TO INVESTIGATE PATCH-CLAMPED NUCLEAR MEMBRANE

Nuclear patch clamp is an emerging research field that aims to disclose the electrical phenomena underlying macromolecular transport across the nuclear envelope (NE), its properties as an ion barrier and its function as an intracellular calcium store. The authors combined the patch clamp technique with atomic force microscopy (AFM) to investigate the structure—function relationship of NE. In principle, patch clamp currents, recorded from the NE can indicate the activity of the nuclear pore complexes (NPCs) and/or of ion channels in the two biomembranes that compose the NE. However, the role of the NPCs is still unclear because the observed NE current in patch clamp experiments is lower than expected from the known density of the NPCs. Therefore, AFM was applied to link patch clamp currents to structure. The membrane patch was excised from the nuclear envelope and, after electrical evaluation, transferred from the patch pipette to a substrate. We could identify the native nuclear membrane patches with AFM at a lateral and a vertical resolution of 3nm and 0.1nm, respectively. It was shown that complete NE together with NPCs can be excised from the nucleus after their functional identification in patch clamp experiments. However, we also show that membranes of the endoplasmic reticulum can contaminate the tip of the patch pipette during nuclear patch clamp experiments. This possibility must be considered carefully in nuclear patch clamp experiments.     

PC—12细胞离子单通道开放状态的检测

本文对用片膜钳技术记录的PC-12细胞钾通道数据进行了连续分组平均开放时间分析,检测到通道活动的三种开放状态．并用正态密度函数对通道平均开放时间的频数分布进行了拟合,估计了各状态的开放持续时间的均值、方差等参数．本文提供的方法,在通道的数据分析中具有广泛的应用价值．     

一种改进的适用于膜片钳记录的成年大鼠海马神经元急性分离法

本文建立了一种快速、可靠的急性分离成年大鼠海马神经细胞的方法。此法可将实验大鼠的年龄提高到500d以上,体重300g以上;不损伤神经细胞膜的电学特性：形态上有差异的细胞易于分辨。用膜片钳技术的单通道和全细胞模式证实,在本实验条件下,约95％左右的健康细胞均能形成高阻抗封接,并成功地记录了电压依赖性钾、钠、钙通道,外向整流氯通道和大电导的钙激活钾通道电流。     

Bay K8644及nifedipine对大鼠下丘脑神经元L-型Ca~(2 )通道特性的影响

采用神经元急性分离和膜片箝技术以及细胞贴附式方式记录通道活动 ,探讨DHP类Ca2 通道激动剂BayK8644及拮抗剂nifedipine对下丘脑神经元L 型Ca2 通道的影响。结果显示 ,在BayK8644作用下 ,通道开放形式发生变化 ,明显可见多级开放 ;通道平均开放时间、平均开放概率显著增加 ,但单通道电导无明显变化。nifedipine的作用与BayK8644相反。结果提示 ,BayK8644对下丘脑神经元L 型Ca2 通道有明显激动作用 ,nifedip ine有显著抑制作用     

小脑皮质神经元K^＋单通道电流的生理特性

用膜片钳技术的细胞贴附式和内面向外式,在分离培养的新生大鼠小脑皮质颗粒细胞膜上记录到钾离子通道电流,有以下的生理特性,最常见的通道电导为２５ｐＳ,单通道电流幅度、开放时间、开放概率均受膜电位控制,通道开放时间分布直方图可用双指数拟合,无时间依赖性失活,不依赖钙离子,能被ＴＥＡ阻断,表明此通道可能为延迟整流型Ｋ＋通道。提示,小脑皮质颗粒细胞存在有不失活的２５ｐＳ钾离子通道,不同于文献报道的,可能是一种新亚型的钾离子通道。     

恒流灌注分离心肌细胞及膜片钳记录钾电流方法学探讨

目的探讨膜片钳实验中豚鼠、大鼠心肌细胞急性分离过程中的观察指标和影响因素,并进行膜片钳记录。方法使用改进的Langendorff恒流灌注法分离心肌细胞和全细胞膜片钳记录钾通道电流。结果分离即刻,存活细胞可达80%以上,复钙后约40%～50%呈静息状态,余出现自发性收缩,存活细胞能够进行膜片钳封接,于室温KB液中可成活8 h以上。结论使用恒流灌注法,观测灌注压的变化,可以较客观的掌握酶解消化的程度,利于获取生理状态良好的心肌细胞。且细胞能够进行膜片钳实验。