一种适于丝状真菌基因RNA干扰方法的研究

目的：获得一种适于丝状真菌基因研究用的、由根癌农杆菌介导的RNA干扰方法。方法采用基因重组及菌株干扰体系筛选的方法。结果获得适于根癌农杆菌转染的重组载体PCB309?pfgrt,并将其成功用于对孢子丝菌双组份信号组氨酸蛋白激酶DRK1基因的干扰中。结论该方法优化了根癌农杆菌的转化体系,解决了丝状真菌RNA干扰载体构建困难及干扰效率低下的难题,在丝状真菌基因功能及遗传转化研究方面具有广泛的应用前景。     

一种农杆菌介导的赤霉菌CCRC3.572的转化方法

目的:建立农杆菌Ti质粒介导的转化赤霉菌的新方法。方法:以农杆菌Ti质粒pCAMBIA0390为基础,构建带有潮霉素抗性基因表达盒的双元载体,并用农杆菌介导的方法转化赤霉菌。结果:构建了双元载体pCAMBIA0390-hph(PgpdA),并获得了具有潮霉素抗性的赤霉菌转化子。结论:农杆菌介导的方法适于赤霉菌的转化,为赤霉菌的遗传研究提供了一种新的手段。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系北大核心CSCD

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。     

一种遗传转化方法在海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中的应用

海洋红酵母作为一种产油微生物富含油脂和类胡萝卜素,但由于没有合适的遗传操作方法,无法对细胞反应器进行理性改进,阻碍了它的进一步发展。首先利用农杆菌介导转化成功构建了海洋红酵母的遗传操作平台。参考完成基因注释的圆红冬孢酵母基因组信息,分离其甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子,以基于圆红冬孢酵母密码子优化的潮霉素作为筛选标记,构建载体转化至农杆菌AGL1中,利用农杆菌介导转化成功得到潮霉素抗性表型正确的转化子,通过表型验证,基因型验证以及Western blot在蛋白水平验证,鉴定了hyg基因的有效表达,证明了外源抗性基因成功导入海洋红酵母菌株中,实现了海洋红酵母新的转化方法的建立。     

根癌农杆菌介导的地衣型真菌Cladonia metacorallifera的转化

以潮霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为筛选标记,利用地衣型真菌Cladonia metacorallifera的菌丝,成功实现了根癌农杆菌介导的遗传转化,PCR检测证明转化子中存在潮霉素抗性基因,共聚焦显微镜检测到转化子菌丝能够产生绿色荧光,证明EGFP能够在trp C启动子控制下在地衣型真菌中表达。     

农杆菌介导凝乳酶基因转化黑曲霉载体的构建

目的:研究针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因( glaA)位点,构建含有潮霉素抗性的农杆菌介导的牛凝乳酶基因转化黑曲霉基因置换载体,并在潮霉素基因两端设计了正向重复序列,使在后续的研究中消除抗性基因成为可能.方法:将glaA上游( Gla5)和下游(Gla3)片段作为同源臂,通过重叠延伸PCR技术连接在Cym基因两端构成GlaA5-Cym-GlaA3( CYM)片段,并在潮霉素基因下游引入与Cym基因下游方向相同的Gla3,通过中间载体获得GlaA5-Cym-GlaA3-hph-Gla3结构.结果:将上述结构克隆至在T-DNA区内只含有多克隆位点的Ti质粒载体pSZA,经过酶切鉴定,成功获得载体pSZH-CYM.     

农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化

【目的】将农杆菌介导的转化应用于重要的工厂化栽培食用菌斑玉蕈中,建立稳定的农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化技术。【方法】将构建的双元载体pYN6982转入农杆菌LBA4404菌株中,以斑玉蕈SIEF3133菌株打碎的双核菌丝为受体材料,利用根癌农杆菌介导的转化方法进行斑玉蕈转化试验。【结果】经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定以及有丝分裂稳定性试验验证,表明潮霉素磷酸转移酶基因(hph)已经整合到斑玉蕈的基因组中;转基因斑玉蕈菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)已经在转基因斑玉蕈菌株中获得了表达;通过PCR检测,随机挑选的8个转基因斑玉蕈菌株中有2个可以扩增出载体转移DNA(T-DNA)边界重复序列外的卡那霉素基因(kan)序列。【结论】获得了稳定遗传和表达的斑玉蕈转基因菌株,建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化方法。农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化中,存在载体T-DNA边界重复序列之外的DNA序列转移到转基因斑玉蕈中的现象,有待进一步研究。     

丹参SmIPI基因RNA干扰表达载体构建及遗传转化北大核心

[目的]构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰植株体系。[方法]利用Gateway技术分别构建SmIPI1和SmIPI2的干扰表达载体p K7GWIWG2D(Ⅱ),并借助根癌农杆菌EHA105菌株介导遗传转化,并通过抗性标记筛选、Egfp荧光和qRT-PCR检测阳性植株和转化效果。[结果]表达克隆构建后转化大肠杆菌菌液PCR检测显示阳性,遗传转化外植体并经抗性培养基继代筛选获得的转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量下调幅度分别在64%~82%和23%~78%之间。[结论]成功构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰表达载体并转化丹参植株,为探索SmIPI基因家族成员各自功能问题提供了研究材料基础。     

间充质干细胞在治疗癫痫所致炎症反应中的作用研究进展

间充质干细胞(MSCs)的免疫调节功能成为近年来的研究热点之一。癫痫是一种以反复发作为特征的复杂性神经系统疾病,而炎症反应是癫痫发生和反复发作的一个重要因素。研究表明,MSCs能够有效治疗多种退行性疾病造成的炎性反应,且发现MSCs可以通过炎症微环境发挥免疫调节功能。简要综述了MSCs在治疗癫痫所致炎症中的作用,旨在为临床应用MSCs防治癫痫提供理论依据。     

国产驴蹄草的细胞地理学研究（英文）

为探讨国产毛茛科(Ranunculaceae)驴蹄草属(Caltha)两种植物的演化,该文利用传统染色体压片技术和流式细胞术,并结合前人染色体研究结果,对我国驴蹄草23个居群和花葶驴蹄草10个居群进行了细胞学研究。结果表明:驴蹄草是由四倍体(2n=4x=32)、六倍体(2n=6x=48)和八倍体(2n=8x=64)构成的多倍体复合群,花葶驴蹄草具有四倍体(2n=4x=32)和八倍体(2n=8x=64)两种倍性水平。驴蹄草和花葶驴蹄草均是四倍体较为常见,目前尚未见有二倍体报道。由于驴蹄草和花葶驴蹄草大部分居群采自中国青藏高原地区,可能在冰期时存在古二倍体,其适应性较弱,逐渐被其他的倍性取代,这是由于不同细胞型对环境适应性的结果。驴蹄草可能存在两条进化路线:一条是从甘肃到达云南;另一条是从西藏到达云南。前期分子系统学研究显示花葶驴蹄草与驴蹄草的亲缘关系较近,该研究结果中花葶驴蹄草染色体比驴蹄草要小,花葶驴蹄草可能比驴蹄草相对进化。目前花葶驴蹄草只有10个居群,还需进一步增加居群量来解析其演化路线。     

计算生物学分析在基因组编辑研究中的应用

基因组编辑是对基因组遗传信息进行定向改造的技术,其中CRISPR/Cas系统是目前应用最广泛的基因组编辑新技术。将先进的高通量测序以及相关计算生物分析应用于基因编辑研究,可进一步优化基因编辑效率和精度等检测流程,实现对全基因组功能基因筛选的监测。同时,利用基于生物信息及机器学习和深度学习等新方法,可对向导RNA(gRNA)的高效设计和实现对编辑效果的预测。本文将对计算生物学分析在CRISPR/Cas基因编辑系统的应用及研究进展等进行概述。     

基于固态基底的SERS免疫检测新方法研究

目的:通过引入新型表面增强拉曼散射(SERS)检测探针(Au-DTNB-Tyr NPs)和金标银染技术,建立基于固态硅片基底的SERS免疫检测新技术。方法:羊抗人IgM-HRP作为检测抗体,在硅片基底上检测不同浓度的人IgM,HRP催化SERS检测探针沉积,利用金标银染技术增强SERS信号。结果:所建立的SERS免疫检测新方法检测人IgM的检测限为10 pg/mL,且SERS信号强度与人IgM浓度具有良好的线性关系(R2=0.993)。结论:基于硅片基底的SERS免疫检测新技术可高灵敏地定量检测人IgM,为实现固态硅片基底对多种抗原的高通量集成化检测奠定了基础。     

激光共聚焦显微技术在瓮安生物群中的应用

激光共聚焦显微技术是一种以激光作为激发光源,通过特殊装置"针孔"来过滤离焦光线以提高光学分辨率和对比度的光学成像技术。由于大部分化石不能自发荧光,该技术在古生物学领域尚未实现大范围的应用。但若围岩能自发荧光而与化石之间具有一定衬度,或化石因含特殊成分能在特定波段激光照射下自发荧光而产生结构衬度,则可以运用激光共聚焦显微技术获得在普通光学显微镜及荧光显微镜下难以清晰观察到的信息。为推动激光共聚焦技术在古生物学领域中的应用,文中系统介绍了该技术的原理与使用方法,并以埃迪卡拉纪磷酸盐化特异埋藏的瓮安生物群微体化石为例,展示了该技术在化石成像中的若干优势。实验结果表明,瓮安生物群微体化石因富含磷灰石可自发荧光实现成像,使用激光共聚焦显微成像技术观察瓮安生物群化石薄片不仅可以获得较好衬度,而且还能提高成像的分辨率和清晰度。此外,在化石薄片的厚度范围内还可以实现化石结构三维重建。     

抗肿瘤药物Rigosertib研究进展

Rigosertib是一种非ATP竞争性多激酶抑制剂,具有显著的抗有丝分裂和抗癌活性,可诱导多种肿瘤细胞增殖停滞和凋亡,对正常细胞增殖的影响很小。Rigosertib已作为高危骨髓增生异常综合征患者的治疗药物应用于Ⅲ期临床试验。本文就Rigosertib的分子作用机制、体内外抗肿瘤活性以及临床试验等方面的研究进展做简要综述。     

新型2-喹诺酮类Polo样激酶1抑制剂的设计合成及分子对接研究

目的:设计合成新型2-喹诺酮类Polo样激酶1(Plk1)抑制剂。方法:以Plk1抑制剂ON 01910为先导化合物,利用生物电子等排原理设计一系列2-喹诺酮类衍生物,用Autodock软件将该类化合物与Plk1进行分子对接和虚拟筛选,计算结合自由能;以取代的氯(溴)苄为起始原料,先后经巯基乙酸取代、双氧水氧化、与(对甲氧基)苯胺酰化,再经环合、水解制得目标化合物。结果:设计的化合物大多数与Plk1的结合自由能均比ON 01910的低,结合强度高、稳定性好;合成了16个2-喹诺酮类衍生物,产物结构经1H-NMR确证。结论:所得化合物中有15个为新化合物,化合物的结构设计科学合理,虚拟筛选结果良好,为后续实体筛选和化合物结构优化提供了理论依据和参考。     

基因编辑技术的发展及其在农业生产中的应用

对动植物和人类基因组的测序为功能基因组研究提供了基础数据。然而,核苷酸序列信息并不足以帮助我们了解特定的基因组元件的功能及其在表型形成中的作用。基因编辑技术能够在很大程度上解决这一问题,帮助人们快速获得新的基因组突变模式,从而以更便捷高效的方式进行功能基因组研究。对基因编辑的基本原理及常见的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)和2013年出现的CRISPR/Cas9系统进行了回顾,讨论了基因编辑技术的应用历史,特别在农业应用方面,重点关注了CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用,阐述了CRISPR/Cas9在基因组编辑领域的问题和其他应用方面的困难,探讨了基因编辑工具在作物改良方面所面临的主要挑战和未来发展趋势。     

碱基编辑技术的发展与应用

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换。自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器。在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能。本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望。