Nox2在AngII诱导的H295R细胞醛固酮合成中的作用

摘要 目的：观察Nox2对AngII活化的人肾上腺皮质腺癌细胞（H295R细胞）醛固酮合成的影响。方法：将H295R细胞分为正常对照组、AngII、AngII＋gp91ds-tat（Nox2抑制剂）组、AngII+PEG-Cat（H₂O₂清除剂）组、AngII+Nox2 siRNA组及不同时间的AngII组，采用Q-PCR和western blot检测醛固酮合成酶（CYP11B2）和Nox2基因及蛋白水平；放免法检测细胞上清液醛固酮浓度；应用流式细胞术和酶标仪检测细胞内Nox2来源的ROS和H₂O₂的含量。结果：10 nmol/L AngII以时间依赖性增加H295R细胞内ROS和H₂O₂含量、Nox2和CYP11B2表达、醛固酮合成（P<0.05）。与正常对照组相比，gp91ds-tat和PEG-Cat明显降低AngII诱导的细胞内ROS和H2O2含量（P<0.05），而gp91ds-tat组和PEG-Cat组AngII诱导的细胞内ROS和H₂O₂抑制作用无差别（P>0.05）。10 nmol/L AngII 处理24 h诱导H295R细胞CYP11B2表达（P<0.05），而gp91ds-tat组、PEG-Cat组和Nox2 siRNA组明显抑制AngII诱导H295R细胞CYP11B2表达（P<0.05）。结论：Nox2来源的ROS在AngII诱导的醛固酮合成过程中起主要调控作用。     

TRPA1传导皮肤角质细胞温热信息的机制研究

目的 探究角质细胞中的温热信息是如何被传导至下游背根神经节（DRG）中的TRPA1离子通道。方法 采用单细胞钙离子成像技术,利用TRPA1过表达系统以及野生型和TRPA1基因敲除小鼠,联合TRPA1激动剂（BITC）和抑制剂（HC-030031）检测H₂O₂在DRG神经元温热感知中的作用及其与TRPA1的相关性。在不同温热条件下培养皮肤角质细胞,并提取角质细胞RNA;采用RNA-seq分析比较不同温度培养的角质细胞基因表达异同,筛选皮肤角质细胞传导温热信息的候选因子。结果 过表达TRPA1以及DRG神经元中的TRPA1均可在H₂O₂存在情况下被温热激活,而温热范围内不同温度可影响皮肤角质细胞中与H₂O₂产生有关的趋化因子配体2（CCL2）和核心蛋白聚糖（DCN）基因的表达。结论 H₂O₂相关因子可能参与TRPA1介导的温热传导过程。     

水稻磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶在蛋白质水平上的组织和诱导表达特征

蛋白质是生命活动的主要承担分子,了解蛋白质在有机体中的时空分布对于正确解析蛋白质的功能十分重要．磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (PHGPx) 是目前发现的唯一能够直接还原膜上脂类过氧化物的抗氧化酶,在保护生物膜免受过氧化损伤方面有着重要作用．采用Western blot技术,分析了水稻PHGPx (OsPHGPx) 在水稻不同组织以及多种胁迫条件下的蛋白质表达特征．结果表明,OsPHGPx在成熟水稻植株内主要分布于叶组织中,以旗叶中含量最高,而在水稻幼苗中则在茎及叶组织中均检测到较强的杂交信号．OsPHGPx在幼苗中的表达受到H₂O₂和NaCl的强烈诱导,但植物激素对其表达的影响较弱．H₂O₂和NaCl的诱导效果呈现出时间及剂量的相关性,当用0.5 mmol/L H₂O₂处理12 h或用500 mmol/L NaCl处理24 h,此时OsPHGPx表达量达到最大值．对H₂O₂清除剂二甲基硫脲处理的水稻幼苗,外源H₂O₂的再处理并不能诱导OsPHGPx的表达,而NaCl的诱导效果并不受影响,说明H₂O₂可能并不介导NaCl诱导OsPHGPx的表达．这些结果为进一步研究OsPHGPx在水稻中生物学功能奠定了基础．     

SelS高表达保护人脐静脉内皮细胞免于H2O2诱导的细胞损伤

采用以下方法探讨SelS在内皮细胞中的表达和作用：将SelS基因克隆到真核表达载体pLNCX2，RT-PCR、XhoⅠ/ClaⅠ双酶切以及DNA序列分析验证目的基因；利用脂质体转染技术将pLNCX2-SelS或pLNCX2转染至人脐静脉内皮细胞(ECV₃₀₄细胞)，RT-PCR检测重组基因SelS的表达；MTT方法检测转染后过氧化氢(H₂O₂)对内皮细胞增殖能力的影响；硫代巴比妥酸法测定暴露于H₂O₂中不同转染组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量. 结果表明：成功构建真核表达载体pLNCX2-SelS；转染后重组SelS mRNA表达水平是内源性水平的1.76倍；H₂O₂对ECV₃₀₄细胞损伤后，高表达SelS组细胞活性增强、H₂O₂诱导产生的丙二醛减少. 上述结果表明，高表达SelS可保护内皮细胞免于H₂O₂诱导的细胞损伤，其作用机制与抗氧化有关.     

环黄芪醇治疗白癜风的作用及机制

摘要 目的：探索环黄芪醇（Cycloastragenol,CAG）对白癜风的治疗作用及机制。方法：将正常人皮肤黑素细胞PIG1分组如下：对照组、H₂O₂组、10CAG组、50CAG组和100CAG组,分别使用不同浓度（10、50、100 μM）的环黄芪醇和250 μM的H₂O₂ 与PIG1细胞共培养。通过CCK-8法测定细胞增殖,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,并测定细胞中的黑色素、SOD、CAT和MDA含量。将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和CAG组。通过每天涂抹50 mg 40%的莫诺苯宗乳膏建立白癜风小鼠模型,然后使用50 mg/kg的环黄芪醇治疗小鼠。通过HE染色和Masson-Fontana染色检测皮肤组织中的毛囊和黑色素含量。通过Western blotting检测MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Bax、Bcl-2、p-p38/p38的蛋白表达。结果：与H₂O₂组相比,50CAG组和100CAG组的细胞活力和黑色素含量均升高,凋亡率均降低,Bax蛋白表达水平均降低,而Bcl-2均升高,SOD和CAT水平均升高,而MDA水平均降低（P<0.05）。10CAG组、50CAG组和100CAG组的毛囊和黑色素含量均较H₂O₂组增多。与H₂O₂组相比,50CAG组和100CAG组的MITF、TYR、TRP-1、TRP-2和p-p38/p38蛋白表达水平均升高（P<0.05）。与模型组相比,CAG组的的MITF、TYR、TRP-1、TRP-2和p-p38/p38蛋白表达水平均升高（P<0.05）。结论：环黄芪醇在细胞水平和动物水平上均能促进黑色素合成,对白癜风具有较好的治疗作用,其机制可能与p38信号通路的激活有关。     

Smac/DIABLO在过氧化氢所致C2C12肌原细胞凋亡中的作用

为探讨Smac/DIABLO在过氧化氢(H₂O₂）所致C₂C₁₂肌原细胞凋亡中的作用,采用Hoechst 33258染色,观察H₂O₂ (0.5 mmol/L)处理C₂C₁₂肌原细胞不同时间后,细胞核形态学改变并计算凋亡核百分率,DNA抽提及琼脂糖电泳观察凋亡特征性梯状带,利用细胞成分分离后蛋白质印迹分析H₂O₂是否导致Smac/DIABLO从线粒体释放,采用Caspase检测试剂盒及蛋白质印迹分析Caspase-3和Caspase-9的活化,转染Smac/DIABLO基因,观察Smac/DIABLO过表达对H₂O₂所致的C₂C₁₂肌原细胞凋亡的影响.结果表明:H₂O₂处理1 h后,Smac/DIABLO从C₂C₁₂肌原细胞线粒体释放入胞浆,2 h更明显;H₂O₂处理4 h后,Caspase-3和Caspase-9活化,12 h达高峰;H₂O₂处理24 h后,C₂C₁₂肌原细胞显示特征性的凋亡形态改变,凋亡核百分率明显升高,DNA电泳出现明显“梯状”条带.与单纯过氧化氢损伤组相比,Smac/DIABLO高表达的C₂C₁₂肌原细胞经过氧化氢损伤组的Caspase-3和Caspase-9的活化、凋亡核百分率的升高、“梯状”条带的出现均更明显.结果表明,H₂O₂可导致Smac/DIABLO从C₂C₁₂肌原细胞线粒体释放,促进Caspase-9和Caspase-3的活化而促进细胞凋亡的发生.     

细胞氧化损伤时8-羟基鸟嘌呤的测定

利用H₂O₂易通过细胞膜而到达核这一特点,初步探讨了不同浓度H₂O₂对HL-60细胞DNA的氧化损伤程度.发现H₂O₂浓度在0.4 mmol/L以上时,作用8～24 h可以用气相色谱/火焰离子检测器(GC/FID)检测到氧化损伤标志产物——8-羟基鸟嘌呤(8-oh-G),并观测到在0.4～0.8 mmol/L H₂O₂作用一定时间时,8-羟基鸟嘌呤含量随H₂O₂浓度升高而升高.     

H2O2诱发人成纤维细胞衰老样变化的基因表达谱

以50 μmol/L H₂O₂作用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞4次,使之出现不可逆的衰老表型.提取年轻细胞及H₂O₂处理早老细胞的mRNA,以荧光物Cy3标记年轻细胞cDNA,Cy5标记H₂O₂处理的细胞cDNA,并与点有4 096条人类基因的芯片杂交,利用计算机数据处理判断基因是否存在表达差异.结果显示：有123种基因的表达变化较显著,这些基因参与细胞周期进程、细胞代谢及蛋白质修饰、细胞外基质及细胞骨架蛋白的形成和调节、炎症反应、调节受体酪氨酸蛋白激酶和G蛋白耦联受体信号转导.     

NO和H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用

 NO和H₂O₂是参与植物抗非生物胁迫反应的重要信号分子, 为了确定NO和H₂O₂在大豆(Glycine max)根尖和根边缘细胞(root border cells, RBCs)耐铝反应中的作用及其相互关系, 以‘浙春3号’大豆为材料, 研究了铝毒胁迫下大豆根尖内源NO和H₂O₂的变化, 以及外源NO和H₂O₂诱导大豆根尖和RBCs的耐铝反应。结果表明, 50 μmol·L^–1 Al处理48 h显著抑制大豆根的伸长, 提高Al在根尖的积累, 同时显著增加根尖内源NO和H₂O₂含量。施加0.25 mmol·L^–1外源NO供体亚硝基铁氰化钠(Na₂[Fe(CN)₅NO]·2H₂O, sodium nitroprusside, SNP)和0.1 mmol·L^–1H₂O₂, 能有效地缓解Al对大豆根伸长的抑制、根尖Al积累和RBCs 的死亡, 该缓解作用可以被0.05 mmol·L^–1 NO清除剂2-(4- 羧基苯)-4,4,5,5- 四甲基咪唑-1- 氧-3- 氧化物, 钾盐(C₁₄H₁₆N₂O₄·K, carboxy-PTIO, cPTIO)和150 U·mL^–1 H₂O₂清除酶(catalase, CAT)逆转。并且外源NO能够显著促进根尖H₂O₂的积累, 而外源H₂O₂对根尖NO的含量无显著影响。这表明NO和H₂O₂是诱导大豆根尖及RBCs耐铝反应的两种信号分子, NO可能通过调控H₂O₂的形成, 进而诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应。     

植物叶片中过氧化氢含量测定方法的改进

Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法因背景物质干扰而测得的植物叶片内H₂O₂含量偏高，5％三氯乙酸抽提，活性炭脱色，Ti（Ⅳ）-4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)比色法测得的H₂O₂含量偏低.萃取法有效地脱去丙酮提液中的色素，且H₂O₂的回收率在95％以上.用过氧化氢酶(CAT）处理作空白对照，利用H₂O₂与Ti（Ⅳ）-PAR的显色反应，建立了一种简便、快速、准确的植物叶片内的H₂O₂含量测定方法，H₂O₂的最低检测浓度为0.25 μmol·L^－1.用该方法测得多种植物叶片中H₂O₂的含量在0.1～0.8 μmol·g^－1.