亚致死浓度溴虫腈和毒死蜱对等钳蠊螨生长繁殖和解毒酶的影响

【目的】害虫综合治理中,化学防治对天敌资源也具有一定的杀伤力。为缓解这一矛盾,本研究旨在探究溴虫腈和毒死蜱亚致死浓度处理对等钳蠊螨Blattisocius dentriticus生长繁殖及解毒酶活性和基因表达量的影响。【方法】利用药膜法处理2-3日龄等钳蠊螨成螨24 h,测定溴虫腈和毒死蜱的亚致死剂量;测定和比较LC_(10)和LC_(30)剂量这两种药剂处理后F_0和F_1代的产卵量、产卵期、卵孵化率和雌成螨寿命等生物学特性的变化;通过酶活力分析和RT-PCR分别测定LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂处理后钳蠊螨成螨体内谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)酶活力及其基因表达量变化。【结果】溴虫腈和毒死蜱处理24 h对等钳蠊螨成螨的LC_(50)分别为42.56 mg/L和72.42 mg/L。溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理等钳蠊螨雌成螨后,与对照(清水处理)相比,仅F_0代雌成螨寿命和产卵期显著缩短(P0.05),而产卵量和卵孵化率无明变化。酶活力测定结果发现,GST, CYP450和CarE的活力在溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理后无明显变化,而LC_(50)剂量下,上述3种酶的活力均显著增加(P0.05)。基因表达结果表明,溴虫腈LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量处理下2个GST基因(BdGST3和BdGST6)、3个CYP450基因(BdCYP2-4)和5个CarE基因(BdCarE1-5)表达均显著上调;在毒死蜱这3个剂量处理下3个GST基因(BdGST1,BdGST3和BdGST4)、3个CYP450基因(BdCYP2,BdCYP5和BdCYP6)和2个CarE基因(BdCarE1和BdCarE2)表达量均显著上调。【结论】结果表明,LC_(10)和LC_(30)剂量的溴虫腈和毒死蜱亚致死剂量会抑制F_0代雌成螨的生长繁殖;LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂可诱导等钳蠊螨GST, CarE和CYP450基因表达;LC_(50)剂量能明显诱导等钳蠊螨体内GST, CarE和CYP450活性上升。该研究为等钳蠊螨抗性品系的筛选及田间应用提供了理论依据。     

氟啶虫胺腈对意大利蜜蜂解毒、免疫和记忆相关基因表达的亚致死效应

【目的】新型杀虫剂氟啶虫胺腈广泛用于农业生产中的害虫防治,但其对蜜蜂健康影响的研究较少。本文探究了亚致死剂量的噻虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica 6种解毒相关基因(CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、CYP6AS5和CYP4G11)、4种免疫相关基因(Abaecin、Defensin、Hymenoptaeci和Apidaecin)和3种记忆相关基因(PKA、GluRA和NMDAR1)表达的影响。【方法】采用饲喂法确定氟啶虫胺腈对蜜蜂的经口急性毒性;并用1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈饲喂蜜蜂后48 h,运用荧光定量PCR技术分别检测了蜜蜂脑部解毒、免疫和记忆相关基因的表达变化,并统计各组蜜蜂的死亡率。【结果】氟啶虫胺腈对蜜蜂经口性半数致死剂量LD_(50)为0.099μg/蜂;饲喂1/3 LD_(50)氟啶虫胺腈能够显著抑制蜜蜂Abaecin和Defensin的表达(P 0.05),而PKA、NMDAR1、GluRA、CYP9Q2和CYP9Q3能够被其诱导上调表达(P 0.05);饲喂1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈均能显著诱导蜜蜂Hymenoptaecin、Apidaecin、CYP6AS5和CYP4G11上调表达(P 0.05)。但饲喂1/3 LD_(50)和1/10 LD_(50)氟啶虫胺腈的处理均不影响蜜蜂CYP9Q1和CYP9S1表达。【结论】氟啶虫胺腈的曝露可能会对意大利蜜蜂的免疫、记忆和解毒系统都有一定的影响,这对深入探究氟啶虫胺腈与蜜蜂之间互作的分子机制有一定生物学意义。     

亚致死浓度噻虫嗪对西方蜜蜂免疫相关基因表达的影响

【目的】新烟碱类农药是目前全球应用最广泛的一类农药,大量研究表明亚致死量新烟碱类农药能够影响蜜蜂的采集、学习和记忆等行为。本文主要探究亚致死浓度新烟碱类农药噻虫嗪对西方蜜蜂5种免疫相关基因:Abaecin类抗菌肽(ABA)、Hymenoptaecin类抗菌肽(HYM)、防御素(Defensin,DEF)、葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GLD)和溶解酵素(Lysozyme,LYS)表达及蜜蜂个体生存的影响。【方法】(1)通过饲喂管法确定噻虫嗪对蜜蜂的经口性急性毒性;(2)对蜜蜂长期(10 d)饲喂亚致死浓度(100、10、2.2μg·kg~(-1)噻虫嗪,然后运用荧光定量PCR技术检测了蜜蜂免疫相关基因的表达变化,并统计各组蜜蜂的存活率。【结果】(1)噻虫嗪对蜜蜂经口性半数致死浓度LC_(50)=692μg·kg~(-1);(2)亚致死浓度噻虫嗪对ABA、DEF和LYS表达没有显著影响;但能够极显著的降低HYM表达水平(P0.01);100μg·kg~(-1)噻虫嗉处理能显著增加蜜蜂GLD表达(P0.05)。【结论】研究表明亚致死浓度噻虫嗪能够抑制蜜蜂免疫相关基因HYM表达,这对于从分子水平上探究新烟碱类农药对蜜蜂健康和生存的影响具有一定的生物学意义。     

亚致死浓度氰氟虫腙对小菜蛾三种解毒酶及P450 mRNA表达量的影响

【目的】为探讨亚致死浓度氰氟虫腙对小菜蛾Plutella xylostella(L.)3种解毒酶和细胞色素P450基因表达量的影响。【方法】采用叶片浸渍法,测定用氰氟虫腙LC10和LC25处理72 h后小菜蛾羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶3种解毒酶的活性;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法测定了其在24、48和72 h时对P450基因(Px CYP4、Px CYP6和Px CYP9家族)表达的影响。【结果】结果表明,氰氟虫腙LC10和LC25处理对羧酸酯酶活性影响不显著;对谷胱甘肽S-转移酶活性存在显著抑制作用(P<0.05);LC25处理后多功能氧化酶活性显著增加(P<0.05),为对照的1.39倍。同时,LC25氰氟虫腙处理组小菜蛾P450基因Px CYP4M19、Px CYP6BF1V2、Px CYP6CN1和Px CYP6CV2 m RNA的相对表达量分别为对照组的2.33~8.5倍、1.32~3.48倍、1.18~2.53倍、2.02~7.22倍。【结论】结果显示,氰氟虫腙可能通过诱导这4种P450基因m RNA的上调表达而增强了小菜蛾多功能氧化酶酶活性。     

三种新烟碱农药对西方蜜蜂生存和生理的联合影响

为探究亚致死浓度的3种常用新烟碱农药噻虫嗪、吡虫啉和噻虫胺两两混合对西方蜜蜂生存以及乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性的联合影响,本研究通过饲喂管法检测这3种新烟碱农药对西方蜜蜂的经口性急性毒性。用各农药的LD_(10)值作为处理剂量,检测LD_(10)的各农药及其两两混合处理西方蜜蜂后48 h蜜蜂的死亡率,并检测各处理组蜜蜂乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性变化。3种农药两两互混后与单一农药相比均能显著增加西方蜜蜂的死亡率(P0.05);噻虫嗪和吡虫啉以及噻虫嗪和噻虫胺联合用药均对蜜蜂毒性具有协同增效作用(Q1.15)。所有农药处理组蜜蜂的乙酰胆碱酯酶活性均显著高于对照组(P0.05),其中噻虫嗪与噻虫胺混合组乙酰胆碱酯酶的活性最高;噻虫嗪和吡虫啉以及噻虫嗪和噻虫胺两两互混后与单一农药处理组相比均能显著增加蜜蜂乙酰胆碱酯酶活性(P0.05)。除噻虫嗪与噻虫胺互混组对蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶活性具有明显的抑制作用(P0.05),其他农药组谷胱甘肽S-转移酶活性均没有明显变化。新烟碱类农药噻虫嗪和吡虫啉以及噻虫嗪和噻虫胺互混处理组能够协同增加对蜜蜂的毒性,而且农药混合与单一农药处理相比能引起蜜蜂不同的生理变化。本研究利于更深入了解和探究混合农药对蜜蜂健康的影响,并为保护蜜蜂提供一定理论基础。     

果蝇CYP6G1真核表达及其对新烟碱类杀虫剂的体外代谢

【目的】CYP6G1是黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内重要的P450酶，其底物谱广泛，除了介导黑腹果蝇对DDT的抗性之外，还与其对新烟碱类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性密切相关，但目前CYP6G1的代谢功能与黑腹果蝇抗药性之间的因果关系还缺乏一些直接证据。【方法】本研究通过建立Bac-to-Bac昆虫杆状病毒真核表达系统，功能性地表达了果蝇细胞色素P450酶CYP6G1,以吡虫啉为阳性对照，利用超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)和超高效液相色谱串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)分析CYP6G1对噻虫啉和噻虫嗪的体外代谢情况。【结果】孵育2 h后，重组CYP6G1能够羟基化吡虫啉和噻虫啉，使它们的含量分别减少17.6%±7.1%和4.2%±2.3%;重组CYP6G1可以促进噻虫嗪转化为噻虫胺，使噻虫嗪含量减少5.8%±2.1%。【结论】本研究结果为果蝇CYP6G1的...     

三种杀虫剂亚致死剂量对草地贪夜蛾细胞色素P450基因表达的影响

【目的】为明确杀虫剂亚致死剂量对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda细胞色素P450基因表达的影响。【方法】本研究采用叶片浸渍法测定了3种杀虫剂[氯虫苯甲酰胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和苏云金杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)]对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力,以及通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)技术测定了这3种杀虫剂亚致死剂量(LC_(10))处理后48 h时草地贪夜蛾2龄幼虫16个P450基因的表达量。【结果】氯虫苯甲酰胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和Bt对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC_(10)值分别为0.931, 0.283和1 089.688 mg/L。2龄幼虫受LC_(10)氯虫苯甲酰胺胁迫后,13个P450基因(CYP4G75,CYP6AB12,CYP6B50,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A59,CYP9A58,CYP6AE44及CYP6AE43)表达上调,其中CYP6AE44表达量为对照的34.60倍;2龄幼虫受LC_(10)甲维盐胁迫后,11个P450基因(CYP4G75,CYP6AB12,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A58,CYP6AE44及CYP6AE43)表达上调,其中CYP321B1表达量为对照的28.70倍;2龄幼虫受LC_(10)Bt胁迫后,11个P450基因(CYP4G75,CYP6AB12,CYP6AN4,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP6AE44及CYP6AE43)表达上调,其中CYP6AE44表达量为对照的40.80倍。【结论】草地贪夜蛾2龄幼虫的多个P450基因受这3种杀虫剂亚致死剂量处理后表达上调,其中CYP4G75,CYP6AB12,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP321B5,CYP6AE44及CYP6AE43均能被这3种杀虫剂诱导表达。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响

摘要: 【目的】吡虫啉(imidaclorprid)是广泛使用的新烟碱类杀虫剂之一。大量研究表明亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)幼虫的发育和成年蜜蜂的采集、学习等行为。本实验旨在探究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂内勤蜂(1日龄成年工蜂)与外勤蜂(21日龄成年工蜂)免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响,进而为蜜蜂健康的维护提供科学依据。【方法】测定饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液不同时间后意蜂成年工蜂的存活率;利用荧光定量PCR检测饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液6 d后其体内免疫基因多酚氧化酶基因(PPOA3, GenBank登录号： GB43738), Abaecin类抗菌肽基因(ABA, GenBank登录号： GB18323),葡萄糖脱氢酶基因(GLD, GenBank登录号： GB43007)和解毒基因细胞色素P450基因(CYP450 6a2, GenBank登录号： GB49876)的表达,并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定其体内细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)含量和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力。【结果】1日龄和21日龄意蜂成年工蜂连续饲喂6 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组(饲喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液)无显著差异;连续饲喂9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,1日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组无显著差异,而21日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组有显著差异。1日龄意蜂成年工蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液6 d后, PPOA3, CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平,细胞色素P450含量以及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势;而21日龄意蜂成年工蜂取食该药液6 d后,CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势,PPOA3表达水平和细胞色素P450含量有显著上调趋势。【结论】亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因的表达及免疫解毒酶系活力;吡虫啉短期胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活无显著影响,长期胁迫则会影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活。     

氯虫苯甲酰胺和甲维盐对草地贪夜蛾幼虫的毒力及解毒酶活性的影响

为了研究氯虫苯甲酰胺和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的毒杀作用及解毒机制,采用叶片浸渍法测定了2种杀虫剂对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC_(10)、LC_(20)与LC_(50),并研究这2种农药的亚致死剂量(LC_(20))对幼虫的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞色素P450(CYP450)3种主要解毒酶活性的影响。结果表明甲维盐对3龄幼虫的毒力更高,48 h时LC_(10)、LC_(20)、LC_(50)分别为0.005、0.007、0.013 mg/L。2种农药处理72 h内,幼虫的3种酶活力呈现不同的动态变化。氯虫苯甲酰胺对CarE活力表现先诱导后抑制的作用,在24 h时CarE活力最大(36.75 U/mg);甲维盐对CarE活力表现先抑制后诱导的作用,在72 h时CarE活力最大(42.44 U/mg)。2种农药对GST活性在72 h内的变化一致,均呈现"诱导-抑制-诱导"的规律。氯虫苯甲酰胺处理后CYP450活性与对照相比无显著差异;甲维盐处理36 h、48 h、72 h幼虫体内CYP450活性均显著低于对照。     

氯虫苯甲酰胺诱导甜菜夜蛾细胞色素P450基因上调表达

【目的】明确氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)细胞色素P450基因的诱导表达作用。【方法】采用O-脱乙基香豆素法研究了低剂量氯虫苯甲酰胺处理对甜菜夜蛾幼虫中肠P450s酶活性的影响,应用Real-time PCR方法测定了其对P450基因(CYP9A9, CYP4G37,CYP4S11和CYP6B)和NADPH细胞色素P450还原酶基因(HQ852049)表达的影响。【结果】氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾P450酶及相关基因的诱导作用均表现出时间效应和剂量效应,。甜菜夜蛾4龄幼虫取食0.02 mg/kg氯虫苯甲酰胺饲料至5龄, 在蜕皮后6-36 h内, 其P450s酶活性增加为对照组的1.90~2.92倍, 诱导效应高于0.01 mg/kg氯虫苯甲酰胺处理组（其P450s酶活性为对照组的1.11~1.62倍）。同时, 0.02 mg/kg氯虫苯甲酰胺处理组甜菜夜蛾中肠P450基因CYP9A9, CYP4G37和CYP6B mRNA的相对表达量分别上升为对照组的1.97~3.95, 2.46~4.29及1.53~4.48倍, NADPH细胞色素P450还原酶基因 HQ852049 的相对表达量亦增加为对照的1.85~4.08倍。【结论】结果提示,氯虫苯甲酰胺可能通过诱导3种P450基因及细胞色素P450还原酶基因 HQ852049 基因mRNA的上调表达而增强了甜菜夜蛾幼虫中肠P450s酶活性。     

吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相关基因表达及酶活力的影响

蜜蜂作为世界上最重要的授粉性昆虫,在采集过程中易接触到杀虫剂,前人研究表明新烟碱类杀虫剂吡虫啉（imidaclorprid）影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称“意蜂”）的存活和舞蹈、采集等行为。本研究旨在探究亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂哺育蜂（8日龄成年工蜂）免疫解毒相关基因表达、免疫解毒酶系活力及存活率的影响。结果显示哺育蜂连续取食3 d和9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖液后,其存活率与对照组（饲喂含等量丙酮的蔗糖溶液）无显著差异;连续饲喂11 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组有显著差异。荧光定量PCR检测及双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验结果显示哺育蜂取食吡虫啉3 d后,蜜蜂体内免疫基因多酚氧化酶基因（PPOA3,GB43738）,Abaecin类抗菌肽基因（ABA,GB18323）,葡萄糖脱氢酶基因（GLD, GB43007）和解毒基因细胞色素P450基因（CYP450 6a2,GB49876）,细胞色素B561基因（CYB561 2-like,GB40148）,葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase,GB52179）的表达及蜂体内体内细胞色素P450酶（cytochrome P450,CYP450）含量均有上调趋势,超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）均有显著下调趋势;哺育蜂取食吡虫啉9 d后,PPOA3,ABA,GLD,CYP450 6a2,CYB561 2-like,UDP-glucuronosyltransferase的表达及蜂体内体内细胞色素P450酶含量均有下调趋势,多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活力均有显著下调趋势。本研究在分子水平上提供了亚致死剂量吡虫啉是通过扰乱蜜蜂正常的免疫系统进而影响蜜蜂行为的证据,以期为维护蜜蜂健康提供一定的理论依据。     

亚致死剂量毒死蜱对飞蝗细胞色素P450酶活性及基因表达的影响

【目的】研究有机磷杀虫剂毒死蜱对飞蝗体内细胞色素P450的影响。【方法】采用酶活力测定法和实时定量PCR技术分别研究了毒死蜱3种亚致死剂量(LD_(10)、LD_(30)和LD_(50))处理飞蝗3龄幼虫24 h后,体内细胞色素P450酶活性及CYP409A1和CYP408B1基因表达量的变化。【结果】不同亚致死剂量毒死蜱处理引起细胞色素P450活性显著性降低,分别为对照组的0.68、0.50和0.62倍。同时通过mRNA水平表达的差异比较显示,飞蝗的两个P450基因CYP409A1和CYP408B1的表达受到抑制,均出现表达量减少的现象。【结论】某些细胞色素P450基因表达受不同亚致死剂量毒死蜱的抑制而使酶的量被降低,从而造成飞蝗整体细胞色素P450酶活性的下降。     

噻虫啉对西方蜜蜂王浆主蛋白、免疫和记忆相关基因表达的影响

【目的】噻虫啉Thiacloprid是当今应用较为广泛的新烟碱类杀虫剂之一。研究表明亚致死剂量的噻虫啉不仅能够影响蜜蜂的采集和飞行能力,而且还能损害蜜蜂的免疫系统。本文主要探究了亚致死浓度的噻虫啉对西方蜜蜂5种王浆主蛋白基因Mrjp1,Mrjp2,Mrjp3,Mrjp4和Mrjp5 4种免疫相关抗菌肽基因Abaecin,Hymenoptaecin,Defensin1和Apidaecin以及3种记忆相关基因Pka,Creb和Nmdar1表达的影响。【方法】对蜜蜂长期饲喂含有0.2 mg/L和2 mg/L噻虫啉的糖水10 d,然后运用荧光定量PCR技术分别检测了蜜蜂王浆腺中王浆主蛋白基因以及脑部免疫和记忆相关基因的表达变化。【结果】0.2 mg/L和2 mg/L噻虫啉均能显著的抑制5种王浆主蛋白基因Mrjp1,Mrjp2,Mrjp3,Mrjp4,Mrjp5和Apidaecin的表达水平(P0.05),而仅有2 mg/L噻虫啉处理能够能显著抑制Abaecin,Hymenoptaecin,Defensin1和Nmdar1表达(P0.05)。不过,0.2 mg/L和2 mg/L噻虫啉处理对另外两种记忆相关基因Pka和Creb表达没有显著影响。【结论】亚致死浓度噻虫啉可能通过抑制王浆主蛋白基因的表达影响蜜蜂王浆腺的发育,而Nmdar1,Abaecin,Hymenoptaecin,Defensin1和Apidaecin的下调表达则可能预示着噻虫啉对蜜蜂记忆能力生成和免疫系统的损害。我们的研究为深入探究噻虫啉对西方蜜蜂健康影响的分子机制提供了基础。     

Effect of sublethal doses of malathion and carbaryl on the P450 genes of Locusta migratoria

采用实时定量PCR技术检测飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1经马拉硫磷和西维因不同亚致死剂量和不同时间处理后mRNA的表达水平.结果表明,经马拉硫磷不同亚致死剂量LD10、LD30和LD50处理后,飞蝗CYP4G62和CYP6ELI均在高剂量LD50被显著诱导,分别为对照的3.03和2.0倍,而在低剂量LD10无显著性差异.CYP9AQI在3个亚致死剂量下表达量均显著提高,且增量随处理浓度增加而降低.经西维因3个亚致死剂量处理后,除在LD30这一浓度下引起CYP4G62表达提高外,其它的P450基因均无显著性差异.选择2种农药的LD15对飞蝗进行点滴处理,分别检测6、12、24和48h基因的相对表达.经马拉硫磷LD15处理后,除CYP6ELI在12h和CYP9AQI在24h表达量显著降低外,其它各时间点基因表达均无显著差异.经西维因处理不同时间后,3个P450基因的相对表达量均无显著性差异.综合上述结果说明马拉硫磷对3个细胞色素P450基因有一定的诱导作用,而西维因对其无诱导作用.     

意大利蜜蜂职能相关的两个细胞色素P450基因在附肢中的表达分析

[目的]本研究分析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica中细胞色素P450基因CYP6BD1和CYP49A1在不同日龄工蜂及相同日龄不同职能工蜂的附肢中的表达模式,旨在更好了解细胞色素P450基因在不同职能工蜂处理外源物质过程中的作用.[方法]通过组建蜂群收取3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、21日龄采集蜂和21日龄哺育蜂样本,利用荧光定量PCR技术分别检测细胞色素P450基因CYP6BD1和CYP49A1在附肢(触角、前足、中足、后足)中表达情况.[结果]基因CYP6BD1在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、21日龄采集蜂各附肢中的表达量均依次显著增加,且该基因在21日采集蜂各附肢中的表达量显著高于21日哺育蜂;与CYP6BD1基因相比,基因CYP49A1在不同职能工蜂附肢中的表达量均较低,但在3日龄工蜂各附肢中表达相对较高.[结论]基因CYP6BD1和CYP49A1分别在采集蜂和3日龄工蜂各附肢中高量表达,2个基因在降解蜂群外和蜂群内部外源性物质中发挥重要作用,为进一步研究膜翅目昆虫的职能分工提供新的视角.     

球囊菌侵染对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫与解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响

【目的】球囊菌Ascosphaera apis是一种真菌性病原体,可以侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫,导致蜂群患白垩病。本研究通过球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫,探究对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响,分析球囊菌侵染胁迫下意大利蜜蜂免疫应答反应与营养物质的关系。【方法】实验室饲养意大利蜜蜂幼虫,处理组每头3日龄幼虫接种2×10⁶孢子/mL球囊菌,对照组饲喂正常食物;收集6日龄幼虫肠道样品。通过qRT-PCR测定收集的肠道样品中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,并利用生化方法测定肠道样品中蛋白质、脂质、葡萄糖和糖原含量。【结果】球囊菌侵染意大利蜜蜂后,幼虫肠道免疫相关基因LOC406144, Apid1, Def1, Def2, LOC406142, PGRP-SA, Pgrp-s2, PGRP-S3, PGRP-lc, GNBP-1, GNBP3, PPOact, LOC552247, domeless, KAT2A和bsk显著上调表达,cactus显著下调表达;解毒相关基因Cat, GSTS3, Cyp4g11, LOC725294, Ampka-r1, LOC411223, LOC409791, AmNOS和Sod2显著上调表达,CYP6AS14, CPR14, CYP306A1和LOC100576555显著下调表达;发育相关基因usp显著上调表达,VGMC, HEX70b和Vg显著下调表达;病原基因BQCV capsid protein和Ascosphaera apis 28S rRNA表达量显著上升;蛋白质与脂质含量显著下降,葡萄糖与糖原含量显著上升。【结论】球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后影响其幼虫肠道中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,影响意大利蜜蜂的免疫应答及能量应激反应,加速蛋白质、脂质的流失及葡萄糖和糖原能量储备,影响机体正常的生理活动。     

烟粉虱不同发育阶段解毒代谢酶基因的特异性表达

【目的】基于烟粉虱Bemisia tabaci转录组数据,系统分析了烟粉虱解毒代谢酶基因在噻虫嗪抗性品系中的表达模式,探讨了这些基因在烟粉虱不同发育阶段差异表达的生物学意义。【方法】分别收集室内长期饲养的烟粉虱噻虫嗪抗性和敏感品系的卵、4龄若虫和刚羽化1 d的雌成虫,在烟粉虱转录组数据库中挑选8 394条解毒代谢相关基因设计探针,通过探针杂交,得到烟粉虱噻虫嗪抗性品系表达谱芯片,比较了这些基因在抗性烟粉虱3个不同发育阶段的表达情况。并随机挑选了9个基因,在抗感品系间3个不同发育阶段进行了荧光定量PCR验证。【结果】在抗性烟粉虱的卵和4龄若虫发育阶段,共有3 424个差异表达基因,其中489个是编码3类解毒代谢酶(羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P450多功能氧化酶)的基因;有14个基因在4龄若虫发育阶段过量表达,其中10个为P450基因,4个为GST家族基因。在抗性烟粉虱的4龄若虫和雌成虫发育阶段,总共有1 273个差异表达基因,193个为3类解毒代谢酶家族的基因,其中有9个P450家族基因在雌成虫期的表达量超过4龄若虫期的10倍。此外,表达谱芯片分析还筛选到了一些候选抗性基因。qRT-PCR验证显示在这些候选基因中,与敏感品系相比,9个基因在抗性烟粉虱的3个不同发育阶段表达上调,其中GST基因家族的p_06027和P450基因p_06013在抗性品系的卵和4龄若虫中过量表达;p_05885和p_07806和编码CYP6家族蛋白的p_00988在抗性品系的4龄若虫期的表达量上调;p_05916和p_00478在抗性品系卵和4龄若虫期表达量很低,而在成虫期过量表达;而p_00059和p_00428在抗性品系雌成虫发育阶段表达量显著上调,其中编码CYP4C1的p_00059的差异表达倍数在雌成虫期约为15.15倍。【结论】表达谱芯片分析结果提示,CYP6和CYP4C1基因的过量表达可能会是烟粉虱抗性产生的机制之一。解毒代谢酶基因在烟粉虱不同发育阶段的特异性表达,可能与其在抵御杀虫剂胁迫时体内能量的分布及有效利用率有关,也可能是害虫在环境选择压下的一种适应机制。     

亚致死剂量马拉硫磷和西维因对飞蝗P450基因表达研究

采用实时定量PCR技术检测飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1经马拉硫磷和西维因不同亚致死剂量和不同时间处理后mRNA的表达水平。结果表明,经马拉硫磷不同亚致死剂量LD10、LD30和LD50处理后,飞蝗CYP4G62和CYP6EL1均在高剂量LD50被显著诱导,分别为对照的3.03和2.0倍,而在低剂量LD10无显著性差异。CYP9AQ1在3个亚致死剂量下表达量均显著提高,且增量随处理浓度增加而降低。经西维因3个亚致死剂量处理后,除在LD30这一浓度下引起CYP4G62表达提高外,其它的P450基因均无显著性差异。选择2种农药的LD15对飞蝗进行点滴处理,分别检测6、12、24和48 h基因的相对表达。经马拉硫磷LD15处理后,除CYP6EL1在12 h和CYP9AQ1在24 h表达量显著降低外,其它各时间点基因表达均无显著差异。经西维因处理不同时间后,3个P450基因的相对表达量均无显著性差异。综合上述结果说明马拉硫磷对3个细胞色素P450基因有一定的诱导作用,而西维因对其无诱导作用。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

棉铃虫中肠P450CYP6B6基因5'上游序列的克隆及序列分析

已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1].为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的方法获得其5'上游区的序列,用启动子区的分析软件进行比对分析,结果得到棉铃虫P450CYP6B6基因5'上游区域1 333 bp的基因片段.分别运用NNPPv.2.2和TRANSFAC v.6.0预测转录起始位点及分析了转录因子结合位点,结果显示,该序列不仅包括TATA盒等这一类核心结构序列,还含有多个转录因子的结合位点,如GATA-1、Dfd、C/EBP、HSF、cytR和AhR(芳香烃受体化合物应答元件)等.该结果为深入研究棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定分子基础.