Saposin C下调LNCaP细胞雄激素受体的多泛素化降解（英）

本研究旨在证实鞘脂活化蛋白C(saposin C)对雄激素受体（AR）多泛素化降解的影响及其机制. 通过将真核表达载体saposin C转染LNCaP细胞,发现saposin C上调AR的蛋白水平和转录激活活性. 进一步将野生型和突变型泛素质粒Ubwt和UbK48R分别与saposin C 共转染LNCaP细胞发现,saposin C能够促进AR蛋白的单泛素化形式的稳定性,抑制AR的多泛素化修饰及其在蛋白酶体中的降解. 其分子机制是saposin C、Ub和AR三者形成复合体,抑制了AR的进一步多泛素化过程. 同时还发现,在这一机制中,细胞内低浓度的雄激素（0.1 nmol/L）与saposin C具有协同作用.     

槲皮素对前列腺癌细胞增殖及转录因子Sp1功能的抑制作用

雄激素受体(androgenreceptor,AR)作为核转录因子,其高表达、基因突变以及AR辅激活因子的过表达等造成AR的异常激活与前列腺癌细胞的增殖、恶化转移、多药耐药等密切相关.天然黄酮槲皮素(quercetin),是一很有潜力的预防和治疗前列腺肿瘤的化合物.槲皮素不仅抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖,并呈剂量依赖性,而且下调前列腺癌中AR的表达、抑制AR的转录激活功能.GCbox是AR核心启动子的主要正调控元件,是转录因子Sp1的结合位点.细胞转染结果表明,槲皮素能抑制Sp1蛋白对AR启动子的激活作用,可能是槲皮素下调AR表达的机理之一.进一步研究显示,槲皮素还能明显抑制Sp1蛋白对AR转录激活功能的增强作用.Western印迹结果显示,槲皮素对Sp1蛋白表达无明显影响,但能够诱导c-Jun的高表达,而高表达的c-Jun蛋白能逆转Sp1蛋白对AR的转录激活作用,由此推测,槲皮素可能通过介导c-Jun与Sp1的蛋白质相互作用,抑制Sp1的功能,进而起到抑制AR表达和功能的作用.免疫沉淀结果又进一步证实了Sp1与c-Jun二者的相互作用.因此,槲皮素可能通过抑制前列腺癌细胞中AR的表达和功能抑制了细胞的增殖,其分子机理可能与槲皮素诱导的c-Jun与Sp1蛋白相互作用、降低Sp1对AR的转录激活作用有关.     

阻断MAPK通路促进雄激素受体招募NCoR并抑制前列腺癌细胞生长

雄激素受体(androgen receptor,AR)是配体调节的转录因子,与前列腺癌的生长和内分泌治疗密切相关.醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate,CPA)作为雄激素的拮抗剂已用于前列腺癌的治疗.结合了CPA的AR可与核受体协同抑制因子作用.已证实丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)可介导生长因子和雄激素受体的信号转导通路的交互作用.我们报道,激活的MAPK抑制结合了CPA的AR招募核受体协同抑制因子(nuclear receptor corepressor,NCoR)至雄激素反应元件上.应用MEK的抑制剂U0126阻断MAPK通路可促进结合了CPA的AR和NCoR相互作用并通过对NCoR的招募增加抑制AR的功能从而阻遏AR靶基因的表达.此外,联合使用CPA和U0126处理稳定表达NCoR的LNCaP细胞可显著抑制前列腺癌细胞的生长.本研究表明,联合应用AR的拮抗剂和MAPK抑制剂有助于前列腺癌的治疗.     

Cancer Cell揭示泛素化信号调节细胞选择性自噬的分子机制

<正>2014年7月15日,Cancer Cell在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所胡荣贵研究组与多家单位合作的研究新成果:具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1,通过介导细胞自噬受体蛋白Optineurin(OPTN)的泛素化修饰,促进细胞自噬受体复合物形成,"激活"细胞自噬,从而抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。该研究团队发现具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶HACE1能够与自噬受体蛋白OPTN蛋白直接相互作用,并催化OPTN的多泛素化,被泛素化的     

NIRF泛素化p53的作用过程中NIRF与p53结合域的测定

NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger protein)是2002年发现的一种核蛋白,其功能涉及细胞增殖调节、蛋白多聚泛素化降解、细胞癌变进程控制等领域．已有研究报道,NIRF能与p53相互作用, NIRF本身也是一个高度调节蛋白,在细胞正常的生理状态下发挥泛素化E3连接酶的作用,结合p53并将其降解,但NIRF与p53结合的蛋白结合域目前尚不清楚．本文研究证明,NIRF能与p53结合成复合体参与泛素化蛋白降解途径,并测定出NIRF与p53结合的区域．为了检测NIRF的蛋白结合域,将空载体和NIRF缺失突变体质粒分别转染于HEK293细胞,蛋白表达水平通过Western印迹用两种抗体分别检测. 结果显示,所有的突变体都能在细胞中表达,并且两种抗体检测结果完全一致. 同时,免疫共沉淀技术用于进一步分析实验结果. 由于泛素化蛋白通常伴随蛋白酶体通路介导的降解,免疫共沉淀的蛋白纯化过程中用蛋白酶体抑制剂MG-132以抑制蛋白降解. 本研究结果显示,NIRF 通过PHD区域与p53形成复合体. 该复合体可能参与蛋白分选、蛋白降解、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的细胞活动,从而形成与细胞增殖相关的新的信号通路,在肿瘤的发生发展中可能发挥某种程度的作用．     

靶向蛋白质泛素修饰及降解在前列腺癌治疗中的机遇与挑战

前列腺癌是中国发病率增长最快的男性肿瘤,抗雄激素治疗耐药是导致前列腺癌患者预后差的主要原因。因此,解决耐药性难题是前列腺癌转化研究的关键问题。哺乳动物细胞利用泛素-蛋白酶体系统实现蛋白质的靶向降解。因此,前列腺癌中关键的癌基因如雄激素受体（AR）的上游泛素化调控因子（如去泛素化酶）是潜在的治疗靶点。然而,这些酶具有较广的底物谱系,存在脱靶的可能性。近来,基于泛素-蛋白酶体系统开发的蛋白质降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras,PROTAC）技术是最具前景和革命性的新型抗癌药物研发技术,能够利用特定E3泛素连接酶对靶蛋白进行降解而不影响其他底物。与传统小分子抑制剂相比,PROTAC分子在克服耐药性以及针对不可成药的靶点方面拥有巨大优势。目前,针对AR的PROTAC降解剂已在II期临床取得了成功,靶向蛋白质泛素化及降解途径的新技术将有望为前列腺癌的临床治疗带来新的突破。     

雄激素非依赖性前列腺癌细胞株BCL2和GRB10基因启动子区甲基化研究

目的 探讨基因甲基化在雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)转化过程中可能的作用.方法 采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)细胞株LNCaP和雄激素非依赖性前列腺癌细胞株LNCaP-AI(androgen independent)中生长因子受体结合蛋白10(growth factor receptor-bound protein 10,GRB10)和B细胞性淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukaemia-2 gene,BCL2)的甲基化状态.结果 GRB10基因在LNCaP-AI细胞和LNCaP细胞中的甲基化率分别为9.6％、7.4％;BCL2基因在LNCaP-AI细胞和LNCaP细胞中的甲基化率分别为14.7％、25.3％,这两个基因在LNCaP细胞和LNCaP-AI细胞的甲基化率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 GRB10和BCL2基因的异常表达与基因甲基化无明显相关,而二者是否参与到前列腺癌激素非依赖性到转化过程以及具体机制有待进一步研究.     

泛素融合降解蛋白UFD1的结构与功能

泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质选择性降解的主要途径,参与多种真核生物细胞生理过程,与细胞的生理功能和病理状态有着密切的关系。该途径中UFD1作为泛素识别因子介导泛素化的靶蛋白至26S蛋白酶体降解。该文在概述泛素-蛋白酶体途径作用机制的基础上,对哺乳动物和酵母UFD1蛋白的结构及其在细胞周期调控、转录调控、内质网相关蛋白降解中的功能进行了综述。     

泛素化连接酶HUWE1在相关疾病中的研究进展

泛素化连接酶是泛素蛋白酶体系统中的关键酶之一,主要负责靶蛋白特异性识别以及泛素化系统活性的调控。HUWE1是一类具有HETC(homologous to E6AP C terminus)功能域的泛素化连接酶。研究发现,HUWE1参与细胞凋亡、基因组DNA损伤、肿瘤抑制因子调控和神经细胞分化增殖等重要生理过程。现主要针对泛素化连接酶HUWE1在肿瘤发生、男性生殖系统损伤、胚胎发育异常与神经发育疾病中的研究进展以及调节机制进行综述。     

雄激素通过雄激素受体途径调控垂体肿瘤转化基因(PTTG1)的表达

雄激素能上调大鼠前列腺中垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)的表达,在前列腺癌标本中,发现PTTG1的表达明显高于正常组织.因此,用雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP来研究雄激素调控PTTG1表达的分子机制.在LNCaP细胞中,通过雄激素刺激后,PTTG1的表达明显升高.根据序列分析以及5-缺失体实验(deletion)和突变实验(mutation),发现PTTG1的启动子上游-950到-933的序列上有1个雄激素受体反应元件(ARE),染色体免疫共沉淀实验(CHIP)也证实了雄激素能促进雄激素受体与PTTG1启动子上ARE结合,从而在转录水平调控PTTG1的表达.     

miR-221促进前列腺癌LNCaP细胞系神经内分泌样转化

目的:研究miR-221对于前列腺癌细胞的神经内分泌化改变的影响,探讨miR-221在前列腺癌的雄激素剥夺治疗中发挥的作用.方法:免疫组织化学研究雄激素依赖性前列腺癌与雄激素非依赖性前列腺癌中NSE表达的差异.在前列腺癌细胞LNCaP上,观察基因转染前后miR-221对于LNCaP细胞的形态学改变,以及通过qRT-PCR和Western-blot方法检测细胞中NSEmRNA水平以及NSE蛋白表达的变化.结果:①免疫组化显示AIPC标本的NSE水平明显高于ADPC标本(P<0.05);②形态学观察:转染miR-221的前列腺癌细胞神经内分泌化改变明显加速③转染miR-221的LNCaP细胞中NSE的mRNA以及蛋白水平均较转染anti-mir-221和miR-NC组明显升高.结论:miR-221对于前列腺癌的神经内分泌化进程有明显的促进作用.     

前列腺癌细胞中雄激素调控核糖体蛋白和氨酰-tRNA合成酶蛋白棕榈酰化修饰

作者对雄激素R1881或DMSO处理的LNCaP细胞进行炔基棕榈酸代谢标记,之后利用点击化学反应形成的共价键富集棕榈酰化修饰蛋白,并对富集蛋白进行质谱定量分析,从而筛选、鉴定棕榈酰化修饰水平受雄激素诱导的蛋白。结果发现,雄激素在LNCaP细胞内促进核糖体蛋白RPL12、RPS4X和谷氨酰脯氨酰-tRNA合成酶(EPRS)棕榈酰化修饰,在细胞上清中促进甘氨酰-tRNA合成酶(GARS)棕榈酰化修饰。对RPL12、RPS4X和EPRS棕榈酰化调控机制的研究将为前列腺癌的治疗提供新的指导思路;雄激素诱导下细胞内RPL12、RPS4X和EPRS棕榈酰化修饰水平的升高可以作为相关的肿瘤标志物,细胞上清中GARS棕榈酰化修饰水平的升高对于前列腺癌的早期筛查具有重要的参考价值。     

抑制eIF3I蛋白的泛素化降解促进人宫颈癌细胞增殖

目的:研究eIF3I蛋白在细胞中的泛素化修饰,阐明其对人宫颈癌细胞系Hela增殖的影响.方法:通过点突变技术获得突变体K282R,与野生型eIF3I比较泛素化的水平,研究细胞内的泛素化修饰调控.经流式细胞仪分析细胞周期,研究野生型蛋白eIF3I和突变体K282R对Hela细胞的细胞周期影响.再从周期蛋白水平研究eIF3I对细胞增殖的调控作用.结果:突变体K282R比野生型eIF3I蛋白的外源表达量大.在Hela细胞中K282R突变体的泛素化水平低,抑制了该蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解.过表达eIF3I能上调周期蛋白Cyclin D1的表达量,促进细胞进入由G1期进入S期.同时,泛素化程度低的突变体K282R具有较强的促进细胞增殖的作用.结论:抑制eIF3I的泛素-蛋白酶体途径降解能上调周期蛋白CyclinD1的表达,促进肿瘤细胞增殖,提示eIF3I在细胞增殖和肿瘤发生发展中发挥作用.     

人泛素连接酶AREL1催化结构域的晶体结构

泛素化是一种重要的翻译后修饰,几乎调控着生命活动的所有方面.泛素连接酶是泛素化过程中唯一对底物蛋白质有特异性识别能力的一类酶,它们在泛素化过程中是不可或缺的,起到非常关键的作用.人抗凋亡E3泛素连接酶(AREL1)是HECT泛素连接酶家族成员之一,它能够泛素化促凋亡蛋白SMAC、HtrA2和ARTS,并通过蛋白酶体将它们降解,从而发挥抵抗细胞凋亡的作用.本文解析了3.2?分辨率的人AREL1蛋白催化结构域(AREL1HECT)的晶体结构,并将其与HECT家族中其他成员的结构进行了比对.尺寸排阻色谱和X射线小角散射的结果表明,AREL1HECT在溶液中是以多种聚集状态形式存在的,小角散射的3D模型进一步表明AREL1HECT在溶液中会发生二聚化.这些结果将为AREL1HECT与泛素复合物结构的解析及功能的分析提供坚实的结构基础,为揭示AREL1泛素化底物蛋白质的分子机制提供重要的依据.     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

RhoA的泛素化降解机制及功能

Rho小G蛋白(Ras homology frowth-related,Rho G)家族作为分子开关(molecular switch)在GTP结合的激活形式和GDP结合的非激活形式之间转换,发挥着重要的生物学功能,细胞内Rho小G蛋白的含量可由泛素–蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)降解途径来调控。Rho A(Ras homolog gene family member A,Rho A)是Rho小G蛋白家族成员,其功能涉及细胞极性、细胞迁移、细胞周期调控、神经系统发育等,通过UPS途径对该蛋白在细胞内的含量进行调控,可保证细胞的相关正常生理功能。在Rho A泛素化降解过程中,不同的泛素连接酶(ubiquintin ligases,E3)发挥了重要的作用。该文将简单介绍UPS的过程和Rho A蛋白质的结构、功能,详细论述Rho A泛素化降解过程的分子机制和生物学功能。     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

E3连接酶RNF148泛素化降解TSPAN15

真核生物蛋白的泛素化是细胞维持对某些受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平的基本调节方式,泛素-蛋白酶体途径对蛋白质降解、运输和免疫反应过程的控制等细胞功能起着非常重要的作用．本研究揭示了一个功能未知、具有RING结构特征的Ⅰ型穿膜蛋白RNF148的泛素化降解功能．通过流式筛选、免疫共沉淀、浓度梯度依赖降解实验及泛素化检测等实验证明：RNF148与四跨膜区蛋白(tetraspanin)家族的一个成员TSPAN15有相互作用,即RNF148可以泛素化并降解TSPAN15．RNF148的RING结构被突变后,TSPAN15的泛素化被严重影响;而TSPAN15的N端胞浆段的21位赖氨酸和C端278位赖氨酸被突变为精氨酸后,RNF148对其泛素化的程度也降低．TSPAN15经由RNF148泛素化后会连接 K29位或K63位多泛素链,进而导致TSPAN15的转位或降解．本研究证明RNF148作为泛素连接酶可以泛素化降解TSPAN15．     

Mex-3C研究新进展：结合RNA的泛素E3连接酶与染色体不稳定性抑制基因

Mex-3C蛋白（又称RKHD2）具备2个串联重复的KH结构域和1个环指结构域,具备结合RNA的能力,同时也是泛素E3连接酶家族的一员.它可以诱导某些mRNA降解,并且这一过程可以被一种去泛素化酶USP7阻断,据此产生了结合RNA的泛素连接酶的概念并暗示泛素化可能与mRNA降解之间存在某种联系. Mex-3C可能通过利用该特性参与调节某些生理功能.另一方面,结直肠癌细胞MEX3C基因缺陷可以导致染色体不稳定性的产生,由此提出了染色体不稳定性抑制基因的观点.DNA复制应激被证实介导了两者之间的相互作用.本文将从这两个新概念出发介绍Mex-3C现有的研究进展,并指出后续的研究方向.