快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

植物蛋白的体外泛素化检测方法

泛素激活酶(E1)、泛素耦联酶(E2)和泛素连接酶(E3)是蛋白质泛素化修饰的关键酶。在真核基因组上有大量基因编码这些泛素化相关的酶类或蛋白。检测这些泛素化修饰酶及其底物蛋白的生化特性和特异性是分析其生物学功能的重要内容。该文提供了一种简便快速检测体外泛素化反应的方法, 不仅可通过检测对DTT敏感的硫酯键的形成来判断E2的活性、检测E3的体外泛素化活性, 而且可以检测E2-E3和E3-底物的特异性。所用蛋白主要来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana), 包括分属于绝大多数E2亚家族的成员, 可用于不同RING类型E3的活性检测。该方法不仅可以采用多种E2进行E3活性分析, 而且可以分析不同组合的E2-RING E3、RING E3-底物的泛素化活性等, 亦可应用于真核生物蛋白质尤其是植物蛋白的体外泛素化活性分析。     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

植物蛋白的体外泛素化检测方法

泛素激活酶(E1)、泛素耦联酶(E2)和泛素连接酶(E3)是蛋白质泛素化修饰的关键酶。在真核基因组上有大量基因编码这些泛素化相关的酶类或蛋白。检测这些泛素化修饰酶及其底物蛋白的生化特性和特异性是分析其生物学功能的重要内容。该文提供了一种简便快速检测体外泛素化反应的方法, 不仅可通过检测对DTT敏感的硫酯键的形成来判断E2的活性、检测E3的体外泛素化活性, 而且可以检测E2-E3和E3-底物的特异性。所用蛋白主要来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana), 包括分属于绝大多数E2亚家族的成员, 可用于不同RING类型E3的活性检测。该方法不仅可以采用多种E2进行E3活性分析, 而且可以分析不同组合的E2-RING E3、RING E3-底物的泛素化活性等, 亦可应用于真核生物蛋白质尤其是植物蛋白的体外泛素化活性分析。     

泛素化修饰调控脱落酸介导的信号途径

泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,通过调节蛋白的活性和稳定性等影响其功能的发挥,在真核生物的生命过程中具有非常重要的作用。泛素化修饰通过精细地调控植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)的合成和信号转导过程的关键因子,影响植物对ABA的响应,参与植物生长发育过程及对干旱、盐和冷胁迫等不良环境的应答。本文概述了植物中泛素化修饰的相关组分(包括泛素连接酶E3、泛素结合酶E2、26S蛋白酶体)和内膜运输相关蛋白,以及这些蛋白调控ABA合成和信号转导过程的最新研究进展,提出该研究领域需要解决的新问题,以期为相关领域的科研人员进一步了解翻译后修饰如何调控激素信号的转导途径提供参考。