灵芝子实体中不同极性的三萜体外抗肿瘤及抗炎活性比较

为了解灵芝中不同极性三萜活性的差异,运用大孔树脂将灵芝总三萜根据极性大小进行分段,采用高效液相法分析各极性部分的HPLC指纹图谱和三萜含量,并比较其对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用和抗炎活性。结果显示D-101大孔树脂可以有效地将灵芝总三萜分为中等极性和低极性两部分,两部分的三萜含量分别为(279.00±2.90)mg/g、(94.52±2.03)mg/g。其中,低极性三萜的体外抗肿瘤活性明显强于中等极性三萜,其对K562、SW620、L1210细胞增殖抑制的IC₅₀值分别为(74.12±1.94)μg/mL、(121.45±2.13)μg/mL、(13.52±1.13)μg/mL。另外,低极性三萜对RAW264.7细胞呼吸爆发的抑制作用也明显强于中等极性三萜。进一步对低极性三萜和中等极性三萜单体的抗炎活性进行比较,发现低极性三萜灵芝烯酸F、灵芝酸DM、灵芝醇B对RAW264.7细胞呼吸爆发的抑制作用明显强于极性较高的灵芝酸C₂、灵芝酸A。该研究阐明了灵芝子实体中不同极性三萜部位的抗肿瘤及抗炎活性并不相同,为将来新药开发和灵芝质量标准的改进建立了基础。     

灵芝液体浅层静置培养高效生产三萜的研究

三萜是灵芝Ganoderma lingzhi中重要的活性物质。本研究采用液体浅层静置培养方式（LSSC）提高灵芝三萜的产量。结果表明,在T25细胞培养瓶中的最佳培养条件为初始培养体积2mL,接种量7.0g （菌体湿重/L）,在48h补加2mL培养液,发酵7d,三萜产量可达(32.95±0.51)mg/g,为摇瓶培养最高产量的2.09倍。进一步经不锈钢平盘放大研究发现,三萜最高产量为(65.91±0.84)mg/g,为摇瓶培养的4.19倍。形态学研究表明,浅层静置培养过程中形成的气生菌丝是提高三萜产量的关键因素。与深层液体发酵相比,液体浅层静置培养具有生长快,三萜产量高,发酵过程不需要搅拌等优点,具有良好的工业化应用前景。     

灵芝悬浮培养中添加微颗粒Talc对灵芝酸产生的影响

灵芝酸是灵芝中重要的药理活性物质,其低产量限制了它的广泛应用和深入研究,高效提高液体发酵中灵芝酸的含量十分必要。以CGMCC 5.65为材料,在悬浮培养条件下,研究添加微颗粒Talc对灵芝酸产生的影响。结果表明,微颗粒Talc添加显著减小了灵芝细胞粒径,对照组为(3.33±0.16)mm,15g/L微颗粒Talc添加组为(2.04±0.12)mm。灵芝细胞中单体灵芝酸和总灵芝酸的含量在微颗粒Talc添加条件下也显著提高。15g/L微颗粒Talc添加组的总灵芝酸含量达到(1.51±0.02)mg/100mg细胞干重,GA-Mk、GA-T和GA-Me的含量最高为(6.02±0.29)、(5.08±0.14)和(1.71±0.09)μg/100mg细胞干重,分别是对照的1.6、4、1.9和1.4倍。另外,15g/L微颗粒Talc添加条件下鲨烯和羊毛甾醇的最大积累量分别为(3.69±0.23)和(34.86±6.41)μg/100mg细胞干重,是对照的2.6和4.2倍;灵芝酸生物合成途径关键基因fps和cyp-5150l8的表达量最高为对照的2.35和1.53倍。     

油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺研究及规模化验证

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分之一,前期研究发现油酸可以促进灵芝三萜液态深层发酵下的发酵合成。本研究主要对油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺进行优化,并进行3L发酵罐规模的验证。通过单因素实验考察油酸的添加方式、添加时间和添加浓度对灵芝三萜的影响,结合响应面实验,获得最优工艺条件并进行验证：在发酵第32h添加1.21%高温灭菌油酸,最高灵芝三萜含量为42.69mg/g;在发酵第7h添加1.35%过滤除菌油酸,最高三萜含量为43.38mg/g,分别比对照提高2.04倍和2.08倍。在1 000mL摇瓶中添加高温灭菌油酸和过滤除菌油酸,灵芝三萜含量分别为32.18和32.48mg/g,为对照的1.96倍和1.95倍;在3L发酵罐规模下灵芝三萜含量分别为28.66和25.13mg/g,为对照的1.62倍和1.42倍。本研究系统优化了油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺条件,并在与工业生产相对应的3L发酵罐上进行验证。该研究可为灵芝三萜的规模化发酵提供重要参考和借鉴。     

9,10-环甲基十七烷酸诱导灵芝三萜酸合成的信号转导和基因表达分析

为探究9,10-环甲基十七烷酸（9,10-CMA）诱导灵芝三萜酸合成的相关信号机制,分析了NO信号的介导作用。结果表明,在NO信号分子介导下,9,10-CMA可有效地刺激灵芝菌丝体中三萜合成关键酶细胞色素CYP450和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活化以及三萜酸的合成。NO可作为灵芝菌丝体中CYP450产生和PAL活化的上游分子发挥作用。在9,10-CMA诱导下,通过荧光定量PCR分析了6个关键酶基因在灵芝三萜酸合成过程的动态表达。结果表明,在9,10-CMA诱导下与灵芝三萜酸合成相关的角鲨烯合成酶基因sqs、细胞色素P450单加氧酶CYP5150L8基因和3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A还原酶基因hmgr的上调最显著,提示这3个酶在三萜诱导过程中具有重要作用。     

HPLC法测定灵芝孢子粉中三萜含量

为准确测定灵芝孢子粉中三萜的含量,运用高效液相建立适合孢子粉的分析测定方法。通过对前处理条件的优化,确定40%乙醇为孢子粉中等极性三萜酸类的最佳提取溶剂,浓缩倍数是子实体提取条件的50倍。通过色谱柱和洗脱条件的优化,建立了包括灵芝酸I、灵芝烯酸C、灵芝酸C2等13种标准品测定方法,方法学考察显示该分析方法精密度、重复性、稳定性的RSD值均小于5%,可以用于灵芝孢子粉中三萜类成分的定量检测。通过5组样品的分析发现,灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F是灵芝孢子粉中的主要三萜类成分,其中灵芝酸A含量最高,平均占样品三萜总量的比例达19.71%;三萜类成分的溶出量与是否破壁没有相关性。三萜类成分在灵芝孢子粉和灵芝孢子油产品中的含量非常低,孢子粉的三萜含量为14.24-99.70μg/g,仅为子实体的1/100,灵芝孢子油中三萜含量也均低于50μg/g,因此三萜类成分不适合作为灵芝孢子粉及其相关产品的定量检测指标。     

过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖的生产

灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分之一,具有多种药理活性,但灵芝多糖的低产量限制了其广泛应用。相关研究表明,灵芝中过表达多糖生物合成相关基因能够提高多糖产量,但过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖产量未有报道。本研究克隆获得了灵芝gmp基因,并成功构建出了过表达gmp基因的工程菌株（GMP菌株）,同时对野生型菌株（WT）和GMP菌株的胞内多糖（IPS）、胞外多糖（EPS）产量以及GDP-甘露糖合成相关基因甘露糖磷酸变位酶1（PMM1）基因及甘露糖磷酸变位酶2（PMM2）基因的表达水平进行了检测。研究结果表明,在悬浮发酵培养条件下,灵芝中gmp基因的过表达增加了灵芝多糖的积累。与WT菌株相比,GMP菌株的EPS以及IPS的含量最高达到了0.991g/L和21.59mg/100mg干重,比WT菌株分别提高了21.1%和19.5%。gmp基因的过表达也提高了基因pmm1和pmm2的表达。与WT菌株相比,GMP菌株中pmm1以及pmm2基因的表达水平分别上调了2.87倍和2.55倍。研究结果表明,过表达gmp基因是一种提高灵芝多糖产量的有效方法,并且过表达gmp基因提高了灵芝多糖的合成及pmm1和pmm2基因的表达。     

富硒灵芝菌丝多糖、蛋白的提取及其体外抗氧化和抗肿瘤活性研究

灵芝具有较强的硒富集能力，其中的硒元素多以硒多糖、硒蛋白等有机硒形式存在。本研究以灵芝菌丝为研究对象，采用不同方法提取菌丝多糖及菌丝蛋白，探究外源施硒对二者的含量及其抗氧化活性的影响，并初步探究了水提多糖和可溶性蛋白的抗肿瘤活性。结果表明，以硒含量为95μg/mL的培养基发酵得到的菌丝体，其可溶性蛋白及硒含量较高，分别为1.630 8 mg/g和36.905 7μg/g;采用超声辅助碱提法时，多糖含量较高，为32.070 9 mg/g,且该多糖的硒含量为33.864μg/g。与对照组相比，富硒组灵芝菌丝体其多糖和蛋白的抗氧化性较强，且均表现出浓度依赖性。此外，富硒灵芝菌丝体其硒多糖对肿瘤细胞的抑制增殖效果较好，对HCCLM、A549和HSC-3肿瘤细胞的IC₅₀值分别为3.765、3.23和2.267 mg/mL;但其硒蛋白对上述三种癌细胞的增殖抑制效果较差，其IC₅₀值分别为636.987、506.97、555.598μg/mL。     

灵芝酸T提高多药耐药性肿瘤细胞对阿霉素敏感性的初步研究

本文分析并探讨了灵芝酸T提高多药耐药性肿瘤细胞(KB-A-1/Dox)对阿霉素敏感性的效果及可能的机理。结果表明:灵芝酸T在较高浓度下对阿霉素敏感型和耐药型肿瘤细胞均表现出细胞毒性并诱导细胞凋亡,IC50约为50μg/mL;经5μg/mL灵芝酸T处理后,阿霉素对多药耐药性肿瘤细胞作用的IC50值减少到0.103μg/mL,与阿霉素对照组的IC502.294μg/mL相比,细胞毒性增加了22.3倍,逆转了肿瘤细胞对阿霉素的多药耐药性。同时灵芝酸T处理可使多药耐药性肿瘤细胞内阿霉素和Rhodamin123含量分别增加40%、20%。以上结果提示灵芝酸T能提高多药耐药性肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。     

核、质基因对肺形侧耳菌丝生长、营养成分及基因表达的影响

本研究通过杂交构建肺形侧耳同核异质菌株N1M1、N1M2和同质异核菌株N1M1、N2M1,比较菌丝形态与生长速度、营养成分以及常见的细胞核基因与线粒体基因的表达量,分析线粒体基因对肺形侧耳菌丝的影响,探讨线粒体基因与核基因的相互作用。由菌丝生长情况可知N1M1和N1M2菌丝形态相似,生长速度差异不显著,N1M1和N2M1菌丝形态差异大,生长速度差异极显著,在菌丝形态与生长速度上细胞核基因作用大于线粒体基因。进一步检测菌株中的主要营养成分发现必需氨基酸与总水解氨基酸含量差异显著,菌株N1M2蛋白含量显著高于N1M1,N1M1维生素C含量是N1M2的1.67倍,菌株N2M1多糖和蛋白含量显著高于N1M1,铁和维生素C含量显著低于N1M1。所以细胞核基因、线粒体基因都能影响肺形侧耳营养成分含量。检测同核异质菌株N1M1、N1M2的7个细胞核常见基因的表达情况发现,N1M2菌丝中6个细胞核基因的表达量都显著高于N1M1,这表明肺形侧耳线粒体基因的不同会影响核基因的表达;同质异核菌株N1M1、N2M1的14个线粒体普通编码蛋白基因表达差异显著,这说明线粒体基因的表达量会因核基因的不同有所差异。综上,肺形侧耳线粒体基因和细胞核基因能够相互影响,共同作用于生命活动。     

甘蔗纤维固定灵芝菌丝及其在液体发酵中的应用

以甘蔗纤维作为灵芝菌丝固定载体,通过扫描电子显微镜观察确定载体固定时间,通过液体发酵灵芝菌丝球大小形态、生物量、胞外多糖和胞外三萜含量确定载体形状、大小与数量。结果表明,灵芝菌丝在载体上固定时间为7d,载体为1.5cm×1.5cm（直径×高度）的圆柱体小块（Y1.5）,接种数量6块,可连续稳定发酵7代。以甘蔗纤维固定发酵制备灵芝液体发酵种子,发酵后菌丝球大小均一,生物量、胞外多糖含量和三萜含量分别提高78%、84%和60%。     

基于香草醛-高氯酸显色反应测定灵芝三萜的方法探讨与修正

本文报道了基于香草醛-高氯酸显色反应的分光光度法定量测定灵芝三萜的修正方法,并对该方法应用进行了探讨和优化。采用此方法检测了灵芝子实体中含量较高的几种三萜酸,结果表明若采用齐墩果酸为标准品检测灵芝三萜,检测结果远低于真实值。在光谱分析上,研究表明对紫外-可见光扫描吸收峰进行面积积分,获得的标准曲线的线性关系更优。     

高速逆流色谱法分离灵芝中的灵芝烯酸B

本实验建立一种快速从灵芝子实体中制备灵芝烯酸B的方法。以沪农灵芝1号子实体乙醇提取物为原料,经过D101大孔树脂粗分,用60%乙醇洗脱后,采用高速逆流色谱对获得的灵芝酸性三萜进行分离制备。确定最佳溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（V/V/V/V,5:5:2:9）,上相作为固定相,下相作为流动相,单因素法和正交实验设计确定高速逆流色谱法分离灵芝烯酸B的最佳工艺为：流速2.0mL/min,转速900r/min,一次上样量为500mg时,制备得到灵芝烯酸B化合物得率为(9.07±0.16)%,纯度为(85.04±3.45)%。用质谱、核磁对得到的灵芝烯酸B进行了结构鉴定。此法操作简单高效,为大量制备灵芝烯酸B提供了参考。     

栽培条件对灵芝子实体的三萜组成及其活性的影响

以不同灵芝品种、不同栽培基质、不同管理方式、不同生长时期获得的灵芝子实体为原料,用95%乙醇超声提取,对提取物进行了含量测定、三萜组成分析和体外抗肿瘤实验。结果表明,不同子实体醇提物中三萜和甾醇类物质的含量在4.60-6.20mg/g之间;高效液相分析发现10种三萜化合物的种类和含量在样品间存在明显差异。所有灵芝子实体醇提物对肿瘤细胞L1210的增殖均有一定的抑制作用,开伞期的灵芝子实体醇提物抑制肿瘤增殖的活性优于其他生长时期。     

栽培条件对灵芝子实体中四种重金属含量的影响

以不同灵芝品种、不同栽培基质、不同栽培方式、不同生长时期获得的菌草灵芝和木屑灵芝为原料,对栽培基质及灵芝子实体中铅、砷、汞、镉4种重金属的含量参照国际标准进行检测,结果表明虽然菌草栽培基质中重金属含量高于木屑栽培基质,但菌草灵芝对重金属富集率远低于木屑灵芝,成熟期的菌草灵芝与木屑灵芝中的重金属含量均低于农业行业标准和国家标准。因此菌草可以替代木屑用作灵芝栽培的营养来源。     

漆酶同工酶基因在斑玉蕈生长发育过程中的表达分析

为了探明漆酶在斑玉蕈生长发育过程中的功能,对斑玉蕈转录测序预测的13个漆酶基因序列进行分析、鉴定和构建分子系统发育树;检测了不同生长发育时期漆酶的活性和漆酶基因表达水平。研究结果显示：13个基因片段中有10个是漆酶基因。不同的漆酶同工酶之间进化关系存在明显差异,大多数漆酶与木腐菌（金针菇Flammulina filiformis和侧耳属Pleurotus）进化关系较近。对斑玉蕈不同生长发育时期的酶活检测结果显示,从斑玉蕈的菌丝恢复期到钉头期,漆酶活性逐渐升高,而在子实体形成后期酶活逐渐降低。对培养40d、60d和80d的菌丝样品以及不同生长发育时期的样品进RT-qPCR检测,结果显示在菌丝营养生长时期,大多数漆酶基因在第40-60天表达量持续增加1-3倍,而在第60-80天时表达量出现降低的情况。而在生殖生长时期,大多数漆酶基因在转色期或者原基期相对表达量达到最大值,并在子实体期出现降低,这与漆酶活性的检测具有一致性。lcc3、lcc7、lcc8和lcc9在斑玉蕈生殖生长过程中相对表达量出现了10-100倍的上调。这说明从菌丝培养到菌丝扭结形成子实体和子实体发育的过程中,不同的漆酶可能发挥着不同的作用,表达量较高的漆酶基因可能对基质降解和子实体形成起主要作用。