基因组编辑技术及其在昆虫遗传转化中的应用

锌指核酸酶、类转录激活因子式核酸酶和CRISPR/Cas技术是近几年发展起来的3种主要基因组编辑技术,其原理都是通过在生物基因组特定位点制造DNA双链断裂损伤,从而激活机体自身的DNA损伤修复机制,在此过程中引发各种变异。基因组编辑技术已在研究基因功能和基因修复中成功应用,基于基因组编辑技术的诸多优点,如CRISPR/Cas技术能对基因组中多个特定位点进行编辑,其有望成为昆虫遗传转化的主要策略。本文就锌指核酸酶、类转录激活因子式核酸酶和CRISPR/Cas技术的基本原理及其在昆虫中的应用做一简介,为今后利用基因组编辑技术进行昆虫遗传转化提供些许参考。     

基因修饰技术研究进展

基因修饰技术是用于基因组定点改造的分子工具,目前主要有锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术和CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas)技术。这些核酸酶都可以在DNA靶位点产生双链断裂(DSB),诱发细胞内源性的修复机制,激活体内非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)两种不同的修复机制,从而实现内源基因的敲除或外源基因的定点敲入。近年来,基因修饰技术已成功应用到细菌、酵母、人类细胞、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、家畜、食蟹猴、拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、小麦和大麦等多种生物,显示了其强大的基因编辑优势。特别是新近出现的CRISPR-Cas9技术,降低了成本,使基因编辑变得简洁、高效和易于操作,得到了很多研究人员的关注。本文系统介绍了以上3种技术的原理及最新研究进展,并对未来的研究和应用做出了展望。     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

基因编辑技术

基因编辑是指通过核酸酶对靶基因进行定点改造,实现特定DNA的定点敲除、敲入以及突变等,最终下调或上调基因的表达,以使细胞获得新表型的一种新型技术。基因编辑技术已被广泛运用于基因结构与功能的研究和多种细胞的基因工程改造,为疾病模型的建立、动植物新品种的培育及基因治疗等的研究提供新的手段。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶技术(ZFN)、转录激活子样效应因子技术(TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白 (CRISPR/Cas) 系统等。本文将对3种基因编辑技术的原理、运用及其最新进展进行综述,以期为相关技术及其运用的研究提供参考。     

基因组编辑技术及其在昆虫研究中的应用

基因组编辑技术是进行功能基因组研究的重要工具．锌指核酸酶技术（ZFNs）、类转录激活因子核酸酶技术（TALENs）以及CRISPR／Cas技术是近年来发展起来的3种主流基因组编辑技术．这3种基因组编辑技术的原理都是通过在生物基因组特定位点制造DNA断裂损伤,从而激活机体自身的DNA损伤修复机制,在此过程中引发各种变异．ZFNs是最早发展的通用基因组编辑技术,可用以实施定点敲除和定点敲入变异,但ZFNs技术的发展受限于构建难度大、成本高等缺点．TALENs技术在ZFNs基础上发展而来,较ZFNs技术而言,TALENs技术具备构建灵活度高、成本低等优势．不同于ZFNs与TALENs技术,CRISPR／Cas技术具有独特的DNA靶向机制,这种机制使其非常适合进行多位点编辑．目前,3种技术都在多种物种中成功测试,例如小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫和家蚕．在后基因组时代,这些新技术工具必将在未来功能基因组研究中发挥重大作用．     

CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术, 与ZFNs和TALENs相比, CRISPR/Cas系统更简单, 并且更容易操作。文章重点介绍了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理及这一技术在基因组定点修饰中的应用, 剖析了该技术可能存在的问题, 展望了CRISPR/Cas系统的应用前景, 为开展这一领域的研究工作提供参考。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。