INH-α对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用

为了研究抑制素α亚基(inhibinα-subunit INH-α)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响,本研究采用细胞化学染色法检测第3天、第5天、第7天细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化。利用RT-PCR和Western blotting检测细胞中的成骨分化早期标志物(Runx2)和晚期标志物(OPN)的mRNA含量及蛋白表达水平。茜素红S染色法检测第21天细胞中的钙盐沉积变化。发现BMP9组ALP活性明显增高,INH-α组ALP活性与对照组相比无明显变化,但联合运用BMP9和INH-α组ALP活性较BMP9组明显降低。此外,BMP9组Runx2和OPN的mRNA含量和蛋白表达水平明显增高,而联用BMP9和INH-α组中的Runx2和OPN水平较BMP9组显著下降(p<0.01)。同样,在茜素红S染色实验中,BMP9组钙盐结节明显增多,染色深;而在联合运用BMP9和INH-α组钙盐结节较BMP9组明显减少,染色变浅。说明INH-α能够抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化作用。     

牙源性间充质干细胞对成骨前体细胞成骨分化的影响

目的:探讨牙源性间充质干细胞对成骨前体细胞成骨分化的影响。方法:将小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1分为两组,观察组为牙源性间充质干细胞与MC3T3-E1细胞共培养,对照组为单一MC3T3-E1细胞培养。采用CCK-8法检测细胞增殖水平,采用酶联免疫法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性并进行茜素红染色,采用qRT-PCR、Western blot检测ALP与骨桥素(osteopontin,OPN) m RNA与蛋白表达水平。结果:细胞共培养1 d与3 d后,观察组的细胞增殖指数、ALP活性显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,观察组的矿化结节显著增加,经茜素红染色呈红褐色。细胞共培养1 d与3 d后,观察组的ALP、OPN m RNA与蛋白相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论:牙源性间充质干细胞能促进成骨前体细胞的ALP、OPN表达,提高ALP活性,增加细胞增殖能力,诱发矿化,从而促进成骨分化。     

bFGF和BMP-2联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形成蛋白-2(BMP-2)联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与骨向分化的影响.方法:体外培养兔骨髓间充质干细胞,在第2代细胞培养液中加入不同浓度的bFGF和BMP-2,依据加入bFGF和BMP-2浓度的不同分为5个实验组(组1:80 ng/ml bFGF;组2:80 ng/ml BMP-2;组3:30 ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2;组4:50ng/ml bFGF 50ng/ml BMP-2;组5:80ng/ml bFGF 80ng/ml BMP-2)和对照组(不加任何生长因子),采用绘制生长曲线,四唑盐比色法(MTT),碱性磷酸酶(ALP)活性检测法和碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色法比较各组间差异,观察不同浓度的bFGF和BMP-2联合应用对兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响.结果:与对照组相比,单独应用80 ng/ml bFGF可显著促进BMSCs的增殖,但对BMSCs的骨向分化显著抑制;单独应用80 ng/ml BMP-2对BMSCs的增殖和骨向分化均有促进作用;30ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2、50 ng/ml bFGF 50 ng/ml BMP-2和80 ng/ml bFGF 80 ng/ml BMP-2可显著地促进BMSCs增殖和促进BMSCs的骨向分化,且呈正性剂量-效应关系,联合应用两种生长因子较二者单独应用促细胞增殖及骨向分化的效果更为显著.结论:一定浓度范围内,bFGF和BMP-2的联合应用促进BMSCs增殖的同时也促进其骨向分化,两者对BMSCs有明显的协同增强的生物学效应.     

机械敏感离子通道Trpm7在LIPUS促进牙髓间充质干细胞成骨分化中的作用机制的研究

该文主要研究低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)促进牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPSCs)成骨分化,以及瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,Trpm7)在其中发挥的作用。培养人DPSCs,流式细胞术检测其表面分子标志表达,阿利新蓝、茜素红及油红O染色检测其成软骨、成骨和成脂分化能力。ALP活性、ALP染色和茜素红染色观察LIPUS促成骨分化的能力。实时定量PCR检测LIPUS处理组与对照组成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达的差异以及不同时间点两组Trpm7 m RNA表达水平的变化。ALP活性检测LIPUS及不同浓度Trpm7抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)对成骨分化能力的影响。实验分为对照组、LIPUS组、LIPUS+二甲基亚砜(DMSO)组和LIPUS+2-APB组,ALP和茜素红染色观察各组成骨分化能力,Western blot检测各组OPN、OCN和RUNX2的蛋白表达。结果显示,成功培养DPSCs,LIPUS处理后ALP和茜素红阳性染色明显增多,ALP活性增强(P0.01);OPN、OCN、RUNX2的m RNA表达水平显著增加(P0.05),LIPUS处理第2天和第5天Trpm7的m RNA表达水平有明显升高(P0.05)。2-APB作用后明显下调ALP活性(P0.01)。LIPUS组、LIPUS+DMSO组与对照组相比,ALP和茜素红阳性染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达均显著增加,而LIPUS+2-APB组较于LIPUS+DMSO组,ALP和茜素红染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达明显降低。该研究结果提示,LIPUS能够促进DPSCs的成骨分化,且Trpm7在这一过程中发挥着重要作用。     

降钙素相关肽诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的机制

目的:研究外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-relate peptide,CGRP)对SD大鼠骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化功能的影响。方法:采用贴壁法分离骨髓间充质干细胞,扩增传代至第三代,根据分组,培养体系中添加含不同浓度(10-11～10-6mol/L)CGRP的条件培养液,WST-1法检测细胞增殖能力;碱性磷酸酶染色及钙结节染色法观察CGRP诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果。采用RT-PCR方法检测碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(COLL-I)、BMP-2、RunX2、骨粘连蛋白(Osteonectin,ON)等成骨相关细胞因子mRNA的表达。结果:增殖率测定CGRP组各浓度均较对照组增加,且呈剂量依赖关系,CGRP浓度大于1×10-10mol/L时差异有显著性(P<0.05);碱磷酶染色与钙结节染色结果显示,CGRP组均有阳性显色,对照组无显色或显色不明显。CGRP组的细胞因子表达较对照组显著升高(P<0.05)。结论:适当浓度的CGRP能够直接促进体外培养的BMSCs增殖,并可短期内诱导其在向成骨细胞分化。CGRP可能在骨修复及骨重建中发挥重要的作用...     

补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响

目的:探讨补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响及其可能机制。方法:选取3月龄无特定病原体级健康雌性SD大鼠25只,通过切除卵巢建立绝经大鼠模型。6周后,通过全骨髓贴壁法分离BMSCs并进行原代和传代培养,传至3代后进行成骨和成脂诱导,并按补骨脂素浓度梯度0、5、10、15、20μmol/L进行处理。细胞增殖2周后,通过碱性磷酸酶(ALP)染色实验和油红O染色观察BMSCs成骨和成脂的分化,应用蛋白免疫印迹法测定核心结合蛋白因子RUNX2、骨钙素(OCN)、增强子结合蛋白β(C/EBP-β)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达。结果:成骨诱导BMSCs在补骨脂素的作用下ALP染色呈阳性反应,且补骨脂素的浓度为15μmol/L时阳性反应最强。RUNX2、OCN蛋白的表达随着补骨脂素浓度的升高而升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与空白组比较,成脂诱导BMSCs在补骨脂素的作用下油红O染色阳性反应程度出现下降,补骨脂素浓度为20μmol/L时,油红O染色阳性率最低。C/EBP-β、PPAR-γ蛋白的表达均随着补骨脂素浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:补骨脂素体外可增强BMSCs成骨分化作及抑制BMSCs成脂分化,可能与其调节RUNX2、OCN、C/EBP-β和PPAR-γ蛋白的表达有关。     

补肾益气活血方及其单味药对人牙周膜干细胞增殖分化的影响

摘要 目的：探讨自拟补肾益气活血方及其单味药当归、补骨脂对体外培养的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖和相关成骨基因表达的影响。方法：分离培养得到hPDLSCs,选取第3代hPDLSCs,细胞增殖试剂盒（CCK-8）检测不同浓度（0 g/mL、1×10^-7 g/mL、1×10^-5 g/mL、1×10^-3 g/mL）补肾益气活血方和当归、补骨脂对hPDLSCs增殖的影响,并确定最佳作用浓度和最佳作用时间;通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测Runt相关转录因子2（Runx2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙蛋白（OCN）相关成骨基因的表达水平,通过茜素红染色观察细胞成骨分化情况。结果：与0 g/mL相比,补肾益气活血方各浓度在第一天和第三天时均能显著促进细胞增殖（P<0.05）,且浓度为1×10^-5 g/mL在第三天、第五天时效果均最为显著（P<0.05）;当归同样在浓度为1×10^-5 g/mL、第三天及第五天时效果均最为显著（P<0.05）;补骨脂则仅在第一天时能显著促进细胞增殖（P<0.05）。与空白对照组比较,1×10^-5 g/mL的补肾益气活血方、当归、补骨脂均能显著提升成骨相关Runx2、OCN、OPN、ALP的表达（P<0.05）,且补肾益气活血方的上调效果最为显著。茜素红染色检测显示,补肾益气活血方可增加矿化结节,促进作用最为显著。结论：补肾益气活血方可促进hPDLSCs的增殖和骨向分化,在治疗慢性牙周炎中有望发挥更大作用。     

川续断提取皂甙促进骨质疏松模型中骨髓基质细胞成骨分化的作用机制研究

摘要 目的：探讨川续断提取皂甙（ASA）促进骨质疏松模型中骨髓基质细胞（rBMSCs）成骨分化的作用机制。方法：选取3月龄的雌性SD大鼠60只,随机分为卵巢切除组和假手术组,每组30只。采取卵巢切除法构建骨质疏松模型。建模成功后采用微型计算机断层扫描获得其松质骨微观结构的三维图像并进行分析。采用CCK-8法测定ASA对卵巢切除组rBMSCs增殖的影响。分析碱性磷酸酶（ALP）活性;荧光定量PCR检测成骨基因ALP、骨桥蛋白（OPN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）的表达情况;蛋白免疫印迹试验检测磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表达情况。结果：与假手术组比较,卵巢切除组骨小梁数量、骨小梁厚度和骨体积分数下降,但骨小梁分离度升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。第4天和第7天,ASA(10^-5 mol/L)组、ASA(10^-6 mol/L) 组、ASA(10^-7 mol/L) 组和ASA(10^-8 mol/L) 组rBMSC增殖均显著高于ASA(0学艺术mol/L)组,以ASA(10^-5 mol/L)最为显著;而ASA(10^-1 mol/L) 组、ASA(10^-2 mol/L) 组、ASA(10^-3 mol/L) 组和ASA(10^-4 mol/L) 组rBMSC增殖显著低于ASA(0 mol/L)组,以ASA(10^-4 mol/L)最为显著,差异均有统计学意义（P＜0.05）。第7天和第14天,ASA(10^-5 mol/L)组、ASA(10^-6 mol/L) 组、ASA(10 ^-7 mol/L) 组和ASA(10^-8 mol/L) 组ALP活性均显著高于ASA(0 mol/L)组,且第14天ALP活性高于第7天,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较,ASA组成骨相关基因ALP、OPN和RUNX2相对mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与ASA组比较,wortmannin组成骨相关基因ALP、OPN和RUNX2相对mRNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较,ASA组PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与ASA组比较,wortmannin组PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：ASA能促进骨质疏松模型rBMSCs增殖,增强ALP活性,增强ALP、OPN和RUNX2的表达,而PI3K通路抑制剂wortmannin降低了这些成骨作用,并降低了ASA诱导的PI3K、p-AKT水平,表明ASA通过PI3K/AKT信号通路促进骨质疏松模型rBMSCs成骨分化。     

SFRP5抑制BMP9诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的:探讨脂肪因子分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein 5,SFRP5)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的影响。方法:将人脐带间充质干细胞根据不同的处理因素分为4组:对照组、BMP9组、BMP9+SFRP5组和SFRP5组;分别在3天、5天和7天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性读数,7天进行ALP染色,21天进行茜素红染色检测钙盐沉积及油红O染色;收集不同组的细胞用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,获取的标本进行HE、Masson染色,Alcian blue染色及油红O染色检测。Western blot检测成骨分化相关蛋白Runx2和OPN的表达。结果:BMP9组的ALP活性读数和染色结果和茜素红染色结果均较对照组增加,而BMP9+SFRP5组则较BMP9组降低;BMP9处理后出现少量脂滴,而BMP9+SFRP5组脂滴明显增加,SFRP5组脂滴最多;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,对照组和SFRP5组没有形成肉眼可见的皮下包块,BMP9组和BMP9+SFRP5组能生成异位骨;4周后观测大体标本以及进行MicroCT检测,发现BMP9+SFRP5组的骨密度值小于BMP9组(P0.05)。HE、Masson染色,Alcian blue染色结果显示,BMP9组的骨分化程度大于BMP9+SFRP5,油红O染色结果示BMP9+SFRP5组有较多的成脂分化;SFRP5能抑制BMP9诱导的Runx2、OPN的蛋白质表达。结论:SFRP5抑制BMP9诱导的人脐带间充质干细胞成骨分化。     

尿酸影响人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中BMP-2 表达

目的:探讨在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)成骨分化过程中,不同浓度尿酸(UA)对骨形态形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响。方法:以全骨髓贴壁培养法分离h BMSCs,将生长状态良好的第3代h BMSCs分为5组,分别为空白对照组(加入完全培养基)和成骨诱导组(加入成骨诱导液及含0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L尿酸的完全培养基)。连续干预诱导14d后,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,通过观察茜素红染色情况及检测碱性磷酸酶(ALP)活性进行成骨情况的检测。RT-PCR技术检测各组细胞BMP-2 mR NA的表达情况。结果:第3代h BMSCs大多为形态单一的长梭形,呈旋涡状生长;干预诱导后的细胞逐渐变成不规则的立方形,局部形成团块状结节,以含尿酸浓度为0.8 mmol/L的成骨诱导培养基最为显著。连续干预14d后,空白对照组茜素红染色为阴性,而各成骨诱导组细胞茜素红染色结果为阳性,提示干预诱导后的细胞为成骨细胞。碱性磷酸酶活性随尿酸浓度的增加和干预时间的延长而增强(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,空白对照组无BMP-2 mR NA的表达。成骨诱导组随培养基中尿酸浓度的增加,BMP-2 mR NA表达逐渐增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:尿酸上调h BMSCs向成骨细胞分化过程中BMP-2 mR NA的表达。     

Vibration loading promotes osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via p38 MAPK signaling pathway

Low magnitude high frequency vibration (LMHFV) exhibits effectively anabolic effects on the bone tissue, and can promote osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. The role of p38 MAPK signaling in LMHFV-induced osteogenesis remains unclear. In this current study, LMHFV loading was applied to BMSCs in vitro, and cell proliferation, alkaline phosphatase (ALP), matrix mineralization, as well as osteogenic genes expression were assayed. The mechanism of mechanical signal transduction was analysed using PCR array, qRT-PCR and Western blot. LMHFV increased cell proliferation in the growth medium, while inhibited proliferation in the osteogenic medium. ALP activity, matrix mineralization and osteogenic genes expression of Runx2, Col-I, ALP, OPN and OC were increased by LMHFV. p38 and MKK6 genes expression, and p38 phosphorylation were promoted in LMHFV-induced osteogenesis. Inhibition of p38 MAPK with SB203580 and targeted p38 siRNA blunted the increased ALP activity and osteogenic genes expression by LMHFV. These findings suggest that LMHFV promotes osteogenic differentiation of BMSCs, and p38 MAPK signaling shows an important function in LMHFV-induced osteogenesis.     

The Time-Dependent Manner of Sinusoidal Electromagnetic Fields on Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Proliferation,Differentiation, and Mineralization

Electromagnetic fields (EMFs) are used clinically to promote fracture healing and slow down osteoporosis without knowledge of optimal parameters and underlying principles. In the present study, we investigate the effects of irritation for different durations with 15 Hz 1 mT sinusoidal EMFs (SEMFs) on rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) proliferation, differentiation, and mineralization potentials. Our results show that SEMFs irritation promote rat BMSCs proliferation in a time-dependent manner, and the expression of osteogenic gen [Cbfa 1/RUNX2, bone sialoprotein (BSP), osteopontin (OPN)], alkaline phosphatase activity, and calcium deposition were enhanced after SEMFs treatment depending on the time duration of treatment. To determine the role of MEK/ERK signaling pathway, U0126, a MEK/ERK inhibitor was used. It can suppress rat BMSCs’ proliferation with or without SEMF exposure, and partly attenuate the expression of osteogenesis related proteins (RUNX2, BSP, OPN) which were improved by SEMF. This finding suggests that the effects of SEMF on rat BMSCs’ proliferation differentiation and mineralization are time duration dependent and MEK/ERK signaling pathway plays important role.     

高糖和bFGF对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：骨组织的形成是一个复杂的过程,受多种因素的影响,糖尿病所导致的持续高血糖对于成骨分化的影响机制尚不明确,以及在此分化过程中的各种细胞因子的作用机理仍不明了,现拟通过体外成骨诱导环境,观察高糖和碱性成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactorbFGF）对人骨髓间充质干细胞（humanmesenchymalstemcellshMSCs）成骨分化的影响。方法：hMSC在5．5mmol／L和25mmol／L葡萄糖浓度下培养6天,使用cck一8法测定各组细胞增殖情况;hMSC在两种糖浓度下成骨诱导28天,通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红染色、钙结节半定量检测,对比各组成骨分化活性;在两种糖浓度成骨诱导液中加入10ng／mlbFGF,使用RT—PCR技术检测各组细胞OCN、OPNmRNA表达差异。结果：高糖较正常糖浓度细胞增殖率下降,ALP活性降低,茜素红染色钙结节量减少,RT—PCR检测结果显示25mmol／L组OCN、OPNmRNA表达量低于5．5mmol／L组,加入bFGF后,25mmol／L组仍低于5．5mmol／L组,与未添加bFGF同葡萄糖组比较表达增加。结论：高糖使hMSC增殖能力下降,在成骨分化的过程中ALP活性降低,成骨相关基因OCN、OPN表达量下降,证明了高糖对hMSC成骨分化具有抑制作用,当加入bFGF后,改善了高糖对hMSC的抑制作用,提示糖尿病条件下高糖的存在是导致hMSC成骨分化能力下降的不利因素,同时初步证明了bFGF参与了成骨分化的过程,从而为在分子水平探讨糖尿病患者种植义齿骨结合形成相关机制奠定初步的基础．．     

Comparison of gingiva‐derived and bone marrow mesenchymal stem cells for osteogenesis

Presently, bone marrow is considered as a prime source of mesenchymal stem cells; however, there are some drawbacks and limitations. Compared with other mesenchymal stem cell (MSC) sources, gingiva‐derived mesenchymal stem cells (GMSCs) are abundant and easy to obtain through minimally invasive cell isolation techniques. In this study, MSCs derived from gingiva and bone marrow were isolated and cultured from mice. GMSCs were characterized by osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation, and flow cytometry. Compared with bone marrow MSCs (BMSCs), the proliferation capacity was judged by CCK‐8 proliferation assay. Osteogenic differentiation was assessed by ALP staining, ALP assay and Alizarin red staining. RT‐qPCR was performed for ALP, OCN, OSX and Runx2. The results indicated that GMSCs showed higher proliferative capacity than BMSCs. GMSCs turned more positive for ALP and formed a more number of mineralized nodules than BMSCs after osteogenic induction. RT‐qPCR revealed that the expression of ALP, OCN, OSX and Runx2 was significantly increased in the GMSCs compared with that in BMSCs. Moreover, it was found that the number of CD90‐positive cells in GMSCs elevated more than that of BMSCs during osteogenic induction. Taking these results together, it was indicated that GMSCs might be a promising source in the future bone tissue engineering.