树状多节孢发酵生产紫杉醇工艺条件的初步研究*

研究了树状多节孢HQD33内生真菌融合子TPF-1摇瓶发酵工艺条件,进行了2.8L和10L通用式机械搅拌罐的发酵试验。结果表明,HQD33适宜发酵工艺条件是:发酵时间16～18d,培养基中蔗糖、苯丙氨酸、醋酸钠、酪氨酸、2,4-二氯苯氧乙酸和亚油酸的加量分别为10g/L、1mg/L、1.5g/L、15mg/L、5mg/L和15mg/L,摇瓶装量为150ml/500ml,在此条件下摇瓶发酵液中紫杉醇平均含量为448.52 g/L; 2.8L和10L罐发酵液中紫杉醇含量达406.95和395.12g/L(平均值)。     

树状多节孢发酵生产紫杉醇工艺条件的初步研究

研究了树状多节孢HQD33内生真菌融合子TPF－1瓶发酵工艺条件,进行了2．8L和10L通用式机械搅拌罐的发酵试验。结果表明,HQD33适宜发酵工艺条件是：发酵时间16－18d,培养基中蔗糖、苯丙氨酸、醋酸钠、酪氨酸,2,4-氯苯氧乙酸和亚油酸的加量分别为180g/L、1mg/L,1.5g/L,15mg/L,5mg/L和15mg/L,摇瓶装置为150ml/500ml,在此条件下摇瓶发酵液中紫杉醇平均含量为448．52μg/L;2.8L和10L罐发酵液中紫杉醇含量达406．95和395．12μg/L（平均值）。     

响应面法在紫杉醇产生菌发酵前体优化中的应用

采用响应面法对美丽镰刀菌（Fusarium mairei K178）发酵合成紫杉醇途径中一些可能的前体进行优化研究。首先采用Plackett-Burman法对8个因素进行了筛选,结果表明,苯丙氨酸,苯甲酸钠和乙酸钠三个因素对紫杉醇产量影响较大。在此基础上,再通过Box-Behnken设计,利用Design-Expert软件进行二次回归分析,得到各因素的最佳浓度为：苯丙氨酸2.8mg/L,苯甲酸钠31.8mg/L,乙酸钠3.3g/L。在优化条件下紫杉醇的产量达到242.6μg/L,较前体单因素实验最高值提高15.6%。     

果糖和前体物质对紫杉醇生物合成的影响

研究了果糖和几种前体物质对东北红豆杉生产紫杉醇的影响,结果表明,在第12d加入6g/L果糖可以使紫杉醇产量增加63.89％,在糖协同的作用下,加入前体（0.05mmol/L乙酸钠,0.05mmol/L苯丙氨酸,0.1mmol/L苯甲酸钠）可显著提高紫杉醇的合成,同对照相比,含量分别增加49.36%、13.18%和64.26%,在第15d向培养基中加入0.05 mmol/L乙酸钠、0.1mmol/L苯甲酸钠、1mmol/L苯丙氨酸和6g/L果糖则使紫杉醇含量提高181.89％。     

树状多节孢诱变株与出发株间同工酶差异初探

为了探索紫杉醇产生菌发酵产生紫杉醇的机理,对紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33和经LiCl、紫外线诱变产生的紫杉醇产量正突变的HQD33诱变菌株(P50-2、P1-6、P5-8、L30-2、L50-4)的同工酶和蛋白质(如:过氧化物酶同工酶、脂酶同工酶、淀粉酶同工酶、过氧化氢酶同工酶以及可溶性蛋白和游离组蛋白)的电泳图谱进行了分析,结果显示:除过氧化氢酶同工酶以外其它酶和蛋白质的电泳图谱都有不同程度的改变。可初步推断,诱变使紫杉醇产生菌的分子生物学背景发生了变化,由于遗传背景的改变导致了产生菌细胞内部蛋白质和同工酶的变化,可进一步认为紫杉醇的产生与试验所选的同工酶和蛋白质有一定的相关性。     

补料培养与溶氧控制联合应用对红豆杉细胞培养的影响

为进一步提高红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg.)Rehd .)细胞培养过程中紫杉醇的产量 ,采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响。 5L反应器中补料培养研究表明 ,培养过程中第 16天添加含 2 0g/L蔗糖的补料培养液有利于细胞的生长及紫杉醇的合成。 2 0L反应器中补料培养的研究结果表明 :2 0 %饱和度培养时紫杉醇含量最高 (0 .98mg/gDW) ,但 4 0 %～ 6 0 %溶氧饱和度能提高紫杉醇的产量。进一步研究表明 ,细胞在 6 0 %溶氧饱和度培养 2 0d后转入 2 0 %溶氧饱和度继续培养 12d ,能显著提高紫杉醇产量。补料培养与溶氧控制联合应用时 ,2 0L反应器中红豆杉细胞培养紫杉醇产量可达 18.7mg/L。     

紫杉醇高产菌株的原生质体诱变选育及其遗传变异初探

以紫杉醇产生菌NCEU_1为出发菌株,分别采用紫外线和紫外线与氯化锂复合诱变方法对其原生质体进行诱变,获得了两株高产紫杉醇的突变株———UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 ,其紫杉醇产量从出发菌株的314 0 7μg L分别提高至376 38μg L和392 6 3μg L ;同时,又采用RAPD和同工酶技术对出发菌株NCEU_1与两高产株UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 间的遗传差异进行了研究。结果表明,出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异,为进一步研究与紫杉醇合成相关基因及诱变株产量提高的分子机制奠定了基础     

产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究

对紫杉醇产生菌NCEU-1的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变,筛选制霉菌素抗性突变株,共筛选出了4株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的原生质体诱变菌株——UL_04-5,其紫杉醇产量从出发菌株的314.07μg/L提高至418.24μg/L。     

紫杉醇产生菌及其工程菌株之间的AFLP遗传差异分析

采用AFLP技术对三株紫杉醇产生菌(HQD33、HQD43、HQD54)及HQD33菌株经复合诱变后再经原生质体诱变得到的两株诱变株UL50-6和UV40-19及其融合菌株J1-3进行了分析,结果表明三株紫杉醇产生菌分属不同的种属,同时首次从分子水平上证实Z35-8,J1-3为两株不同的融合子,为下一步的基因工程育种工作中的基因定位和分子克隆提供丰富可靠的分子标记。     

烟曲霉TMS-26产紫杉醇补料分批发酵条件初步探索

内生真菌发酵法是解决紫杉醇药源短缺问题的有效途径之一。本研究以摇瓶分批发酵为基础,进行摇瓶补料分批发酵研究,探究了苯丙氨酸、甘氨酸、苯甲酸钠乙酸钠混合液、3,5-二硝基水杨酸、H₂O₂、CuSO₄在发酵周期（13d）中,不同添加时间点对TMS-26菌体量及紫杉醇产量的影响,发现在第8天添加苯丙氨酸、甘氨酸、3,5-二硝基水杨酸时,其产量分别达到了(664.80±40.34)µg/L、(628.72±30.44)µg/L、(641.36±19.62)µg/L;在第9天添加CuSO₄时,其产量达到了(697.46±15.76)µg/L;在第10天添加H₂O₂、苯甲酸钠乙酸钠混合液,其产量分别达到了(615.78±36.28)µg/L、(792.54±10.04)µg/L。在摇瓶补料分批发酵研究结果的基础上,进行了5L罐发酵工艺放大研究,探究了前体和诱导子通过进行一次补加和恒速补加的方式对Aspergillus fumigatus TMS-26菌体量及紫杉醇产量的影响,结果表明恒速补加苯丙氨酸乙酸钠混合液,紫杉醇产量达到了746.17µg/L。通过本次研究,优化了TMS-26产紫杉醇摇瓶补料分批发酵和5L罐发酵工艺,为后续实现紫杉醇工业化生产奠定基础。     

Effect of the culture medium and biotic stimulation on taxane production in Taxus globosa Schltdl in vitro cultures

Taxus globosa is the only species of the Taxus genus that grows in Mexico. In this study, callus cultures from leaves and young shoots of T. globosa were established in Gamborg’s B5 medium supplemented with 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2 mg/L), kinetin (0.5 mg/L) and gibberellic acid (0.25 mg/L). Callus growth and taxane production were evaluated using two culture media: Woody Plant Medium and Gamborg’s B5 supplemented with picloram (2 mg/L), kinetin (0.1 mg/L) and gibberellic acid (0.5 mg/L). The effect of the inoculum size (50, 100 and 150 g FW/L) and culture media (Woody Plant Medium and Gamborg’s B5) with and without the presence of methyl jasmonate (100 μM) on T. globosa cell suspensions was assessed. Taxane analysis revealed that the calli in Gamborg’s B5 produced taxol (50 μg/g DW), baccatin III, 10-deacetyl baccatin III and 10-deacetyl taxol. Woody Plant Medium also induced the production of taxol, although to a lesser extent. The optimum inoculum size was 50 g FW/L. In cell suspension cultures, both media had a significant effect on taxane production when supplemented with methyl jasmonate. In Woody Plant Medium, at day 14, a total concentration of 197.999 μg/L of taxol, 160.622 μg/L of baccatin III, 633.724 μg/L of 10-deacetyl baccatin III and 229.611 μg/L 10-deacetyl taxol were obtained, with total excretion of baccatin III and 10-deacetyl taxol to the culture medium. In Gamborg’s B5, cephalomanine was obtained at a concentration of 91.428 μg/L without elicitation, and all taxanes were excreted to the medium to a variable extent.     

曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价

红豆杉(Taxus)细胞内紫杉醇的含量低且不稳定,限制了利用细胞培养大规模生产紫杉醇的产业化进程。以紫杉醇含量较高的曼地亚红豆杉(Taxus m edia)为试材,诱导得到了曼地亚红豆杉愈伤组织,在添加抗坏血酸(VC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(activated carbon)的改良B5培养基上,15次反复继代培养后获得了高产紫杉醇的细胞系。对新建立的曼地亚红豆杉细胞系(MC)与同期诱导的东北红豆杉细胞系(NC)及实验室继代多年的中国红豆杉细胞系(SC)在细胞生长周期、紫杉醇含量和细胞死亡率等方面进行了分析比较。结果表明,SC的生长量达5.9倍,高于MC和NC的3.6和4.2倍。在初始接种量相近的情况下,MC的悬浮培养细胞在一个周期内紫杉醇产量可达9.5 mg/L,经过茉莉酸甲酯(M J)诱导后可达到41 mg/L。     

不同施肥处理对曼地亚红豆杉‘Hicksii’生长和紫杉醇含量的影响

采用L9（3^4）正交实验设计,研究了温室盆栽和田间栽培条件下,不同氮、磷、钾施用水平对曼地亚红豆杉‘Hicksii’（Taxus media‘Hicksii’）生长及紫杉醇含量的影响。结果表明,不同的氮、磷、钾施用水平对曼地亚红豆杉‘Hicksii’盆栽苗和田间栽培苗的生长量、枝叶产量和紫杉醇含量有显著影响,影响效应从大至小依次为氮、磷、钾。根据生长综合指标确定最有利于曼地亚红豆杉幼苗生长的氮、磷、钾施用量分别为400、66和200mg·L^-1;最有利于紫杉醇积累的氮、磷、钾施用量分别为200、66和133mg·L^-1。此外,曼地亚红豆杉‘Hicksii’田间栽培苗的生长量、枝叶产量和紫杉醇含量显著高于盆栽苗。     

东北红豆杉细胞培养生产紫杉醇的调控研究

研究了诱导子、前体及抑制剂的协调作用对东北红平杉生产紫杉醇的影响。结果表明,向培养基中加入80mg/L水到、80mg/L茉莉酸甲酯、0.5mmol/L乙酸钠、2mmol/L苯丙氨酸、0.5mmol/L丝氨酸、0.1mmol/L甘氨酸、10mg/L肉桂酸、0.5mmol/L苯甲酸钠、5mmol/L丙酮酸钠、10mg/L氯化氯胆碱、和1mg/L赤霉酸可使紫杉醇含量提高368.65%。并且证明交互作用对紫杉醇合成有显著作用。     

红豆杉高产细胞系快速建立和更新的新方法

目的：通过优化培养基和培养条件,建立太行红豆杉速生细胞系,为红豆杉细胞工厂化生产提供原种细胞系和繁殖技术。方法：以太行红豆杉为材料,筛选B5、WPS、MS等3种培养基和6-卞基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等3种激素组合,采用液体、半固体、纸桥共3种培养方法继代培养并筛选高产细胞系。结果：B5＋NAA（1.0mg/L）＋6-BA（0.5mg/L）＋2,4-D（1.0mg/L）为最适愈伤组织诱导培养基,诱导率达100%;B5＋NAA（1.0～1.5mg/L）＋2,4-D（1.5～2.0mg/L）＋6-BA（0.5mg/L）为最佳继代培养基,生长量最高可达0.30g/（g·d）（鲜重）。结论：初步建立了红豆杉细胞系快速建立和繁殖新方法,用半固体培养产生初代细胞系、液体培养将细胞系同步化、纸桥培养快速繁殖细胞系,并通过检测紫杉醇含量不断更新细胞系。该细胞系体系建立方法简单,纯化速度快,易更新,产物细胞系可作为工厂化生产的原种细胞系。     

红豆杉细胞培养产物提取策略及其对紫杉醇的影响

研究了硫酸铈铵及原位提取对红豆杉细胞悬浮培养过程中细胞生长、紫杉醇合成及释放的影响。红豆杉细胞悬浮培养过程中培养第12d添加2mg/L硫酸铈铵能获得最大紫杉醇产量8．3mg/L,其中2．4mg/L释放到细胞外,分别为对照组的4倍及12倍。同时添加2mg/L硫酸铈铵、5％油酸(v/v)时胞外紫杉醇产量达到9mg/L,为对照组的45倍。将硫酸铈铵及原位提取与补料培养相结合,最高紫杉醇产量可达24．5mg/L,其中60％释放到胞外。     

溶氧水平对红豆杉细胞悬浮培养的影响研究

紫杉醇 (Ｔａｘｏｌ)是源自红豆杉提取物的一种高度衍生化的二萜类化合物 ,临床实验结果表明紫杉醇对于卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌等具有明显的抗肿瘤活性[1] ,因而受到世界各国的广泛关注 ,并已被美国食品与药品管理局 (ＦＤＡ)批准用于卵巢癌与乳腺癌的治疗[2 ] 。到目前为止紫杉醇仍然主要从树皮中提取 ,但由于红豆杉生长缓慢 ,天然资源非常有限 ,加快其替代来源的研究势在必行。利用植物细胞悬浮培养生产紫杉醇作为一种可行的选择 ,近年来取得了较大的进展[3 ,4 ] 。本文研究了摇瓶及 2 0 Ｌ反应器培养过程的溶氧水平对细胞生长及紫杉醇…     

前体促进紫杉醇生物合成的研究

通过正交试验研究了紫杉醇生物合成途径中一些可能的前体对紫杉醇生物合成的促进作用,结果表明,对紫杉醇合成有明显促进作用的前体是苯丙氨酸（１０ｍｇ／Ｌ）、乙酸铵（５ｍｇ／Ｌ）。酪氨酸也有一定的作用。