γ-分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对BMSCs向肺泡上皮细胞分化的影响

为探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch信号通路对BMSCs分化肺泡上皮细胞过程中的影响。本研究采用BMSCs与MLE-12非接触共培养,并在共培养中加入DAPT,实验分3组:空白对照组、共培养组、DAPT共培养组。共培养10 d后用光镜观察BMSCs的形态结构变化,Western blotting和RT-qPCR检测Notch信号通路相关基因Notch1,Ⅱ型肺泡上皮细胞特异性表面活性蛋白(surfactant protein C,SPC)、Ⅰ型肺泡上皮细胞标志水通道蛋白(aquaporin 5,AQP5)的表达。结果表明共培养10 d后的BMSCs变为似铺路石样上皮细胞形态;和空白对照组相比,共培养组、DAPT共培养组中Notch1、SPC、AQP5蛋白及mRNA表达升高(p0.05);与共培养组相比,DAPT共培养组中Notch1、SPC、AQP5蛋白及mRNA的表达减少(p0.05)。因此推测BMSCs在MLE-12诱导下可以定向分化为肺泡上皮细胞,且分化的过程中Notch信号通路被激活,DAPT阻断Notch信号通路能抑制BMSCs分化为肺泡上皮细胞。     

口腔角质形成细胞与成纤维细胞共培养对胶原代谢的影响

目的:了解口腔角质形成细胞与成纤维细胞共同培养对胶原代谢的影响.方法:对口腔粘膜角质形成细胞和成纤维细胞进行了共培养,检测其胶原分泌水平、基质金属蛋白酶的含量及活性、基质金属蛋白酶抑制剂的水平.结果:只有共同培养组才能检测到MMP-9;共同培养组的活化型MMP-2水平与单独培养组相比无显著差异.角质形成细胞与成纤维细胞共同培养组的TIMP-1水平及胶原水平均明显高于单独培养组.结论:口腔角质形成细胞与成纤维细胞共同培养可能主要通过改变基质金属蛋白酶抑制剂的水平而影响胶原代谢.     

γ分泌酶抑制剂对肝血窦内皮细胞的影响

目的:在建立高纯度小鼠肝血窦内皮细胞的体外培养的基础上研究γ分泌酶抑制剂(DAPT)对肝血窦内皮细胞活性的影响.方法:首先通过胶原酶灌注消化、percoll梯度离心和选择性贴壁分离得到高纯度、可在体外条件下培养的肝血窦内皮细胞,其次用不同浓度的DAPT(15 μmol/L、45 μmol/L、75 μmol/L)处理细胞,然后通过MTT检测细胞增殖情况、Real time PCR检测相关分子改变.结果:在体外条件下DAPT对肝血窦内皮细胞的增殖起到促进作用,这种促进作用随着DAPT浓度的增加相应的增加;DAPT能够导致肝血窦内皮细胞Notch信号下游分子Hes1表达下调,VEGF信号中VEGFR1表达下调,VEGFR2表达上调.结论:γ分泌酶抑制剂(DAPT)通过抑制肝血窦内皮细胞Notch信号,引起肝血窦内皮细胞表面VEGFR1表达下调,VEGFR2 表达上调显著增加肝血窦内皮细胞的活性.     

Notch信号参与BMP4诱导的间充质干细胞成骨分化及其机制的初步探讨

目的:探讨Notch信号对骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)诱导间充质干细胞成骨分化的影响以及作用机制。方法:(1)DAPT或Ad-dominant-negative mutants of Notch1(Addn Notch1)和BMP4-CM处理小鼠胚胎成纤维细胞,检测早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP);(2)茜素红S染色实验检测晚期成骨钙盐沉积情况;(3)半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨分化相关基因ALP,Runx2,Col1a1的表达;(4)免疫细胞化学检测p-Smad1/5/8的表达;(5)结晶紫染色和流式细胞术检测细胞的增殖及周期改变。结果:(1)DAPT抑制BMP4诱导的早期成骨分化,且呈浓度依赖性;(2)Delta-like 1(DLL1)促进BMP4诱导的成骨分化,DAPT和dn Notch1抑制BMP4诱导的成骨分化;(3)DLL1促进BMP4诱导的成骨相关基因ALP,Runx2,Col1a1的表达,DAPT抑制这些基因的表达;(4)DLL1促进BMP4诱导的细胞核内p-Smad1/5/8的表达,而DAPT抑制其表达;(5)DLL1促进BMP4诱导的细胞增殖,而DAPT抑制BMP4诱导的细胞增殖。结论:Notch信号通过BMP/Smads信号通路促进BMP4诱导的MSCs成骨分化,在此过程中也有促细胞增殖的作用。     

γ- 分泌酶抑制剂对糖基化终产物作用下心肌微血管 内皮细胞的影响

目的:探讨Notch信号特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移、管样结构的影响。方法:SD大鼠心肌微血管内皮细胞体外分离培养后,以不同浓度DAPT(0.25、0.5、1.0、5.0、10μmol/L)干预200mg/LAGEs作用下的CMECs24h,或者与DAPT(5μmol/L)孵育不同时间(24h、48h、72h、96h、120h),采用MTT比色法检测细胞的增值能力;用Transwell法检测细胞的迁移能力;用毛细血管管样结构形成实验检测DAPT对血管新生的影响。结果:DAPT显著抑制AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的存活,同时浓度越高、时间越长,其抑制效果越明显。结论:DAPT通过阻断Notch信号通路,能抑制AGEs作用下的心肌微血管内皮细胞的增殖及血管新生,促进细胞凋亡。     

BMP2诱导MEFs成骨分化中Notch信号的作用及机制研究

该文研究了Notch信号在骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用及机制。利用过表达Notch配体之一DLL1的腺病毒(adenovirus-delta-like 1,Ad-DLL1)、显性负性突变型Notch1受体的腺病毒(adenovirus-dominant-negative mutant of Notch1,Ad-dn Notch1)或γ-分泌酶抑制剂{N-[N-(3,5-difluorophena-cetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}处理MEFs,细胞化学染色和/或活性测定检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达、钙盐沉积;q RT-PCR、Western blot、荧光素酶分别检测BMP2信号I、II型受体和成骨基因表达、Smad1/5/8蛋白磷酸化水平及Smad结合元件(Smad-binding element,SBE)转录活性。结果显示,DLL1促进BMP2介导MEFs早晚期成骨分化,并上调ALK2等受体的m RNA水平、Smad1/5/8的磷酸化水平及SBE转录活性;与之相对应,dn Notch1和DAPT抑制上述指标。Notch经典靶基因发状分裂相关增强子1(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1,Hey1)可促进BMP2诱导成骨分化,并逆转DAPT对BMP2诱导成骨分化的抑制作用。该研究结果提示,Notch信号促进BMP2诱导MEFs成骨分化,可能是通过激活BMP2/Smads通路实现的,这一过程中Hey1发挥了重要作用。     

Notch3在血管平滑肌细胞中对Erk1/2的调控作用研究

Erk1/2活性在血管许多细胞功能中具有重要影响,而Notch3主要表达在动脉平滑肌细胞中,并且是发育过程中动脉成熟所必需的.为了探讨Notch3在血管平滑肌细胞中对Erk1/2信号通路的调控作用,采用siRNA基因敲除Notch3,γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号通路,质粒转染过表达Notch3活性区等方法,用Western印迹检测Notch3对血管平滑肌细胞中Erk1/2磷酸化水平,即Erk1/2活性的影响.同时,利用活性氧自由基（ROS）诱导激活Erk1/2;siRNA敲除Notch3表达致使血管平滑肌细胞中Erk1/2的磷酸化水平显著降低,并且抑制了ROS诱导的Erk1/2激活;同样,Notch通路抑制剂DAPT也抑制了ROS诱导的Erk1/2激活;而Notch3活性区NICD的过表达并没有改变血管平滑肌细胞中Erk1/2的磷酸化水平,但其延缓了ROS激活后Erk1/2活性的衰减.上述结果表明,Notch3可在血管平滑肌细胞中调控Erk1/2活性以及ROS诱导的Erk1/2信号激活.     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及E-cadherin，COX-2表达的影响

目的:探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及钙粘附蛋白E(E-cadherin)、环氧化酶-2(COX-2)表达的影响。方法:体外培养肝癌细胞系(SMMC-7721、MHCC97H)、正常非肿瘤肝细胞系(HL-7702),Transwell小室用于测定细胞的迁移侵袭能力,Western blot蛋白印迹法用于测定Notch1、E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平,并采用DAPT阻断Notch信号通路,比较肝癌细胞系与正常非肿瘤肝细胞系的迁移侵袭能力及肝癌细胞中E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平的改变。结果:SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞的迁移能力强于HL-7702细胞,差异有统计学意义(P0.05);相比于HL-7702细胞,MHCC97H细胞、SMMC-7721细胞中的Notch1、COX-2表达水平均显著升高,E-cadherin的表达水平明显降低(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞发生迁移的能力均弱于对照组,差异有统计意义(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞内COX-2、Notch1的表达量明显降低,而E-cadherin的表达水平升高(P0.05)。结论:Notch信号通路参与肝癌细胞迁移过程,其机制可能与E-cadherin、COX-2的表达相关。     

抑制Notch信号通路联合沉默Id1对骨肉瘤恶性生物学行为及成骨分化的影响

该研究探讨了抑制Notch信号通路联合沉默Id1对人骨肉瘤细胞MG63的恶性生物学行为及成骨分化的影响。采用Notch信号通路抑制剂DAPT、沉默Id1重组腺病毒分别或联合处理MG63细胞,采用Western blot检测分组处理MG63细胞后Notch1、Jagged1、Id1蛋白的表达;CCK8检测分组处理后MG63增殖能力;流式细胞术检测分组处理后MG63细胞凋亡水平;划痕实验和Transwell检测分组处理后MG63细胞迁移和侵袭能力;碱性磷酸酶、茜素红染色分别检测分组处理后MG63细胞早期、晚期成骨分化能力。结果表明,DAPT处理MG63细胞后,Notch1、Jagged1蛋白表达下调(P0.05),可有效抑制MG63细胞中Notch信号通路活性;抑制MG63细胞中Notch信号通路后Id1蛋白水平表达下降,抑制MG63细胞中Notch信号通路联合沉默Id1后Id1蛋白表达水平最低(P0.05);抑制MG63细胞中Notch信号通路后细胞增殖、迁移、侵袭能力下降,凋亡水平增加和早期成骨分化能力减弱(P0.05);抑制MG63细胞中Notch信号通路联合沉默Id1后细胞增殖、迁移、侵袭能力进一步减弱,凋亡水平最高,早期、晚期成骨分化能力增强(P0.05)。综上所述,抑制Notch信号通路可减弱MG63细胞恶性;抑制Notch信号通路联合沉默Id1后可进一步减弱MG63细胞恶性,促进其成骨分化。     

BMSC共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响

该实验探究人骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)能否通过旁分泌作用影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KF)中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表达,从而影响TGF-β/Smad信号通路。培养BMSC、KF及正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblast, NHDF),使用0.4μm微孔孔径的悬挂式细胞培养皿构建BMSC与成纤维细胞之间非接触的细胞间接共培养模型。通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western blot和qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况。Western blot和qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、Smad7的表达。在成功构建共培养模型后,利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术, Western blot及qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况,结果显示, DNMT1在KF中高表达而在NHDF中呈低表达,共培养组KF较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P0.01)。利用Western blot, qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子的表达,结果显示较非共培养组,共培养组KF中TGF-β1在蛋白水平表达显著降低(P0.01),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(P0.05)。研究证实,人BMSC可能通过旁分泌作用抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞中DNMT1的表达,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖趋于正常。