凡纳滨对虾低温差异表达miRNA的分析鉴定及靶基因的验证

为了解析miRNA及靶基因在凡纳滨对虾低温适应过程中的分子调控机制, 研究开展了凡纳滨对虾常温(28℃)及低温锻炼(16℃, 6d)下肝胰腺小RNA文库的测序和分析。从常温对虾的小RNA文库测序获得18—32 nt的高质量序列10690259条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 57条; 而从低温锻炼对虾的小RNA文库获得18—32 nt的高质量序列序列8587144条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 48条。分析获得25个在低温锻炼下呈显著差异表达的miRNAs。运用qRT-PCR验证了3条低温下差异极显著的miRNAs的表达模式。结果显示, 3条miRNAs的表达模式与高通量测序结果基本一致。预测低温差异表达miRNAs的靶基因, 并与转录组分析获得的低温显著差异表达基因进行比对, 从二者重合的基因集中挑选出4个基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 运用qRT-PCR验证其在不同条件低温锻炼凡纳滨对虾肝胰腺中的表达规律, 为解析miRNAs及其靶基因在对虾低温适应过程中的分子调控机制提供了基础数据。     

月季‘绿萼’花器官发育相关microRNA的鉴定及分析

利用高通量测序技术,构建了中国古老月季‘绿萼’(Rosa chinensis ‘Viridiflora’)和‘月月粉’(R.chinensis‘Old Blush’)花蕾期的microRNA(miRNA)文库,并对其进行了测序和序列分析。结果显示,在‘绿萼’文库中,鉴定到已知的miRNA成熟体39个,miRNA前体42个;预测到新的miRNA成熟体56个,前体57个。在‘月月粉’文库中,鉴定到已知RNA成熟体39个,已知miRNA前体40个;预测到新的miRNA成熟体53个,前体57个。与‘月月粉’相比,‘绿萼’中差异表达的miRNA有31个,其中17个上调、14个下调。荧光定量PCR实验结果表明,miR156、miR398和miR535在2种月季的花蕾期表达上调,而miR167、miR172和miR396表达下调。进一步检测miR172和miR156在2种月季不同花器官中的表达差异,发现miR172在‘绿萼’的花瓣、雌、雄蕊中表达显著下调,提示miR172可能通过负调控其靶基因RcAP2的表达,在‘绿萼’花器官发育过程中起重要作用。     

牦牛体外成熟卵母细胞差异转录组学研究

卵母细胞体外成熟环节是现代繁殖育种技术的基础环节,体外成熟的MⅡ期卵母细胞的质量直接影响了卵母细胞的后续受精及受精卵卵裂.由于卵母细胞的发育成熟是一个涉及大量基因转录调控的复杂过程.因此,转录组学研究是了解卵母细胞发生发育的关键.本研究以高海拔地区的特有牛属动物牦牛(Bos grunniens)卵母细胞作为研究对象,应用RNA-seq技术对牦牛GV期卵母细胞及体外成熟MⅡ期卵母进行转录组学测序及比对分析.经深度测序后,各获得一个包含51380686条过滤测序序列(cleanreads),4624261740碱基(bp)的GV期牦牛卵母细胞测序文库和一个包含50303412条过滤测序序列(clean reads),4527307080碱基(bp)的MⅡ期牦牛卵母细胞测序文库.基因覆盖率统计表明,GV期和MⅡ期文库中分别有16719条和16339条牦牛基因得到转录.通过比较分析MⅡ和GV期转录组数据,共筛选出4767个差异表达基因,其中1418个基因表达量上调和3349个基因表达量下调.GO功能分类注释显示,差异基因与"代谢过程"等生物学过程存在密切关联,同时结合分子功能相关类别等分子事件表现活跃.按表达量上调和下调分别对差异基因进行KEGG通路互作分析,结果表明,凋亡通路、内吞通路及代谢通路是上调的关键调控通路,而代谢通路、丙酮酸代谢、黏着斑及氧化磷酸化是下调的关键调控通路,其中代谢通路在上调及下调通路互作中均起关键调控作用.进一步对代谢通路进行分析,结果表明,组氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及谷胱甘肽代谢是整个代谢通路的关键调控节点。此外,本研究发现,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,与免疫相关的白细胞介素家族及干扰素家族基因发生了显著差异表达.该研究结果为进一步解析牦牛卵母细胞发育的分子机制及全面了解牦牛繁殖的特异性提供了基础.     

急性呼吸窘迫综合征中miRNAs的生物标记作用与调控机制

MiRNAs作为非编码单链RNA分子,具有时空特异性和较高的保守性。近年来,许多实验数据证明,miRNA对细胞基因表达、细胞分化和组织发育等过程有着重要的调控作用,特别是在一些疾病的发生与发展中,miRNAs会异常表达且通过某些机制促进或抑制疾病的恶化。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的发生由多种因素造成,主要临床表现为肺泡-毛细血管损伤。在ARDS发病过程中,一些miRNAs表达异常,且通过调控mRNA转录和表达,参与整个发病过程。在ARDS发病过程中明显上调或下调且具有特异性的miRNA分子可能为ARDS的预前及预后提供新的标志物,同时研究其调控机制也为诊疗提供新靶点。     

日本七鳃鳗物种特异性microRNAs及其前体的识别与验证

MicroRNAs(miRNAs)对参与多种生物代谢过程的基因在转录及转录后水平进行负调控。近年来,随着深度测序及芯片技术的应用,有关miRNA的发现和功能分析在植物和动物中得到广泛研究。文章利用第二代测序技术对日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞的小RNA进行了高通量测序,共得到5 207 787条小RNA序列,其中4 739 346条序列可以拼接为10 989种mi RNA变体。基于序列相似性分析,发现这10 989个变体序列与306个已知的保守mi RNA家族成员序列相匹配;其中,6个保守miRNA家族成员呈极高丰度表达,表明mi RNA在物种间具有保守性。70个未注释序列被预测为新的miRNA。通过miRNA微阵列技术鉴定与验证了34个新预测的mi RNA在免疫处理的日本七鳃鳗白细胞中表达,其中16个mi RNA前体的最低折叠自由能系数大于0.85,说明日本七鳃鳗存在特异性miRNA。这些物种特异性miRNAs的存在可能在日本七鳃鳗的白细胞生长、发育和对疾病的反应中发挥重要的调控作用。     

植物花粉发育miRNAs研究进展

作为一类内源性的负调控因子,植物miRNAs通过沉默靶基因或者翻译抑制来调控基因的表达。到目前为止,用高通量测序技术、miRNA微阵列技术以及实时荧光定量PCR等方法已经鉴定出许多与植物花粉发育有关的miRNAs。越来越多的证据表明,这些miRNAs选择性地存在于花粉发育的各个时期并发挥着特异的调控功能。该文对近年来花粉发育中与miRNAs相关的研究作一综述,介绍了与之相关的研究方法及参与调控花粉发育过程的miRNAs,为深入探索miRNAs调控植物花粉发育的分子机制、通过人工miRNAs技术构建作物雄性不育系以及推动杂种优势的利用提供研究策略。     

基于转录组测序技术进行静原鸡差异miRNA与mRNA的关联分析

为探究静原鸡肌肉组织肌苷酸沉积过程的分子调控机制,本研究以静原鸡胸肌和腿肌组织作为试验材料,通过转录组测序技术,利用生物信息学分析方法筛选出差异表达miRNA及其靶基因.分析结果表明,静原鸡胸肌和腿肌组织的比较组合中有39个差异表达miRNAs(19个显著上调,20个显著下调).通过miRNA-mRNA互作网络分析可知,一个miRNA可以靶向多个mRNA参与调控多个靶基因的表达.GO富集分析表明,候选靶基因的功能主要富集于三个分支的单一生物过程、细胞内和结构分子活性等.KEGG通路注释表明,候选靶基因显著富集到碳代谢、蛋白酶体通路和氨基酸的生物合成等通路中.选取4个差异表达miRNA的与肌苷酸合成和代谢相关的候选靶基因(POLR2C,GMPR,IMPDH2和APRT)进行实时荧光定量PCR验证,结果表明,定量结果与转录组测序结果趋势一致.该研究结果为阐明地方鸡种肌苷酸特异性沉积过程中miRNA介导的靶基因与肉品风味的关系及其表达分析提供理论依据.     

HIV-1感染者中全血miRNA表达谱的变化

初步了解HIV-1感染者全血中miRNA表达谱的变化。使用Taqman低密度miRNA表达谱芯片,分别检测10例HIV-1感染者和10例未感染者全血样本中754条miRNA的表达情况。通过BRB分析软件对样本中miR-NAs的表达情况进行比较,筛选出差异表达的miRNA。使用DIANA在线工具预测差异表达miRNAs的靶基因和细胞功能。筛选结果显示有56条miRNAs显著差异表达(P<0.001),其中有49条miRNAs在感染者中下调,7条miRNAs的表达上调。差异表达miRNAs的靶基因涉及的生物学功能相对集中,主要富集在MAPK、TGF-be-ta、Wnt等信号通路。提示:HIV-1感染引起全血中部分miRNAs表达情况的改变。56条显著差异表达的miRNA可能有着重要的作用,对这些miRNA的进一步研究有望发现新的与致病机制相关的关键分子和HIV-1感染诊断潜在的标志物。     

鳜不同孵化时期miRNA转录组分析及生长相关miRNA鉴定

MicroRNA是一类20-24 nt核苷酸长度的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。利用高通量测序技术获得鳜(Siniperca chuatsi)孵化后第3天、第17天和第28天全鱼miRNA转录组,共鉴定出1 084个miRNAs,其中432个已知、624个保守、28个新发现。第17天时鉴定出的miRNA个数最多,为926个。在3个发育时期都表达的有628个miRNAs,只在各时期中特异表达的分别有71、104和70个miRNAs。一些与鳜发育相关的miRNAs在上述3个时期呈现持续上调或下调的表达特点。进一步的实验表明,miR-199-5p和miR-203可能与鳜生长发育相关,相应的靶基因分别是WnT和MyoD。     

马蔺根系响应Cd胁迫的miRNA高通量测序分析

为了解Cd胁迫下马蔺﹝Iris lactea var. chinensis ( Fisch.) Koidz.〕根系miRNA的表达模式,采用高通量测序法对100μmol·L-1 Cd胁迫0(CK)和24 h(Cd)后马蔺根系的sRNA文库(分别为CK和Cd文库)进行分析,筛选出显著差异表达的miRNA,并对这些miRNA的靶基因功能进行预测;在此基础上,采用qRT-PCR技术对部分miRNA及其靶基因的表达模式进行验证。结果表明：在CK和Cd文库中,未注释的sRNA序列较多,分别占各自sRNA特异序列总数的86.4%和80.5%;在已注释的sRNA序列中,miRNA所占比例最低(分别为0.3%和0.5%),而rRNA所占比例最高(分别为9.4%和11.8%);2个文库中的sRNA长度主要为21~24 nt,且均以21 nt为最多。从Cd胁迫下马蔺根系sRNA中共筛选出32个显著差异表达的miRNA,其中20个miRNA表达量下调(分别属于miR165、miR166、miR167、miR168、miR390和miR396家族),12个miRNA表达量上调。功能预测结果表明：这些miRNA靶基因的功能主要集中在生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面;而从KEGG通路富集分析看,富集在核糖体、氨基酸生物合成和碳代谢3个通路上的差异表达miRNA的靶基因数分别为122、88和82个。 qRT-PCR验证结果表明：在CK和Cd文库间,11个差异表达miRNA及8个靶基因的相对表达量均有显著差异(P<0.05);其中,11个miRNA相对表达量的上调和下调趋势与上述筛选结果一致,并且miRNA相对表达量上调时,其靶基因的相对表达量下调,反之亦然,说明Cd胁迫条件下马蔺根系的miRNA负调控其靶基因的表达,并且这些靶基因主要参与编码转录因子、HD-ZIP蛋白和信号蛋白等过程。     

感染GCRV的草鱼miRNA测序与比较分析

为探索基于高通量筛选抗性主效miRNA功能分子的方法应用于抗性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的选育,研究借助高通量测序鉴定分析感染GCRV前后的草鱼头肾组织中miRNAs.测序结果共鉴定出821个成熟miRNAs,其中118个在GCRV攻毒组特异表达,82个为未攻毒组特有;差异分析结果显示,G...     

建鲤和异育银鲫摄食不同质量饲料时的氮收支和能量收支比较

实验探讨了建鲤和异育银鲫摄食低质和高质饲料时氮和能量的收支情况.低质饲料以豆粕为主要蛋白源,饲料蛋白含量为33.91%,高质饲料以鱼粉为主要蛋白源,饲料蛋白含量为45.59%.55d的生长结果显示,氮收支和能量收支受到饲料质量和鱼类种类的显著影响:摄食低质饲料时,建鲤的生长氮和生长能比例显著低于异育银鲫,排泄氮、排泄能和代谢能比例显著高于异育银鲫;摄食高质饲料时,两种鱼的氮收支和能量收支无显著差异;建鲤的氮收支和能量收支受饲料质量的显著影响,摄食低质饲料时,其生长氮和生长能比例均显著低于摄食高质饲料时,而排泄氮、粪能和代谢能比例均显著高于摄食高质饲料时;异育银鲫的氮收支、生长能和代谢能比例不受饲料质量的显著影响.结果表明,在低质饲料条件下,建鲤利用氮和能量的能力弱于异育银鲫,在高质饲料条件下,两种鱼没有显著差异.与异育银鲫相比,建鲤利用氮和能量的能力受饲料质量的影响更为显著.       

异育银鲫A+系和F系肌间骨的比较分析

研究采用常规测量法和解剖法, 并结合CT透视, 比较分析了异育银鲫主养品种“中科3号”(A+系)和候选新品系F系的肌间骨的数目、形态和分布。结果表明, 6月龄和18月龄异育银鲫F系平均总肌间骨数分别为71.8±2.9和83.3±1.4, 均极显著少于相应月龄银鲫A+系总肌间骨数目(78.6±3.9和87.0±1.5)(P<0.01)。并统计了2个品系的每一肌节的平均肌间骨数目, 6月龄和18月龄异育银鲫F系的每一肌节的平均肌间骨数目极显著少于相应月龄银鲫A+系(P<0.01)。银鲫A+系和F系均有髓弓小骨和脉弓小骨, 没有椎体小骨。6月龄和18月龄银鲫F系髓弓小骨的平均数目为48.2±1.1和55.8±0.52, 均极显著少于相应月龄银鲫A+系的髓弓小骨(53.7±1.6和58.7±0.5)(P<0.01)。异育银鲫两个品系的脉弓小骨数目差异不显著; 2个品系均具有“I”形、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、两端两分叉形、两端多叉形和树枝形7种类型的肌间骨, 髓弓小骨比脉弓小骨数量多且形状复杂。随着月龄的增长, 2个品系具有的总肌间骨数目以及复杂肌间骨数目均增加。6月龄和18月龄银鲫F系躯轴上肌节间的复杂“Y”形髓弓小骨数目均比相应月龄的银鲫A+系少, 而简单的“I”形髓弓小骨数目比相应月龄的A+系多, 表现出一种有利于食用的优势。研究结果为异育银鲫候选新品系F系提供了一个品质评价指标, 同时也为后续进行异育银鲫肌间骨遗传改良提供了形态学基础资料。     

长江中下游鲢鳙草青四大家鱼线粒体DNA多样性分析

对长江中、下游湖北石首、江西九江、安徽芜湖三江段鲢、鳙、草鱼、青鱼天然群体共３６５尾鱼的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）的ＮＤ５／６、Ｃｙｔｂ基因和Ｄ－Ｌｏｏｐ区片段进行了限制性内切酶酶切片段长度多态（ＲＦＬＰ）分析。结果表明：（１）长江中、下游鲢、鳙和青鱼的遗传多样性丰富，草鱼不甚丰富。发现鲢、鳙和青鱼的ｍｔＤＮＡ基因型分别有２８、１９、２７种，草鱼ｍｔＤＮＡ基因型仅见７种；鲢、鳙和青鱼的基因型多样性     

硬化蛋白基因在淇河鲫成鱼不同肌间骨相邻肌组织的表达差异分析

为探究硬化蛋白(sclerostin, SOST)基因在淇河鲫肌间骨不同分布位置中的作用,以淇河鲫成鱼为研究对象,对其肌间骨的形态与分布进行了统计,并在此基础上利用qRT-PCR技术检测SOST基因在淇河鲫背部和尾部肌肉中的mRNA表达,通过Western印迹和免疫组织化学技术检测SOST蛋白的表达定位情况。结果显示：淇河鲫肌间骨包括髓弓小骨和脉弓小骨,髓弓小骨为56～58根,位于淇河鲫背部肌肉的肌隔中,脉弓小骨27～28根,分布于泄殖孔之后的肌隔中。背部肌肉SOST的mRNA表达水平显著高于尾部肌肉（P < 0.05）。与mRNA表达水平相比,背部肌肉和尾部肌肉中SOST蛋白呈现相同表达趋势。免疫组织化学结果显示SOST在肌隔组织中特异性表达,并且在背部肌肉中的表达强烈,尾部肌肉中没有阳性反应。上述结果表明,SOST在淇河鲫肌间骨的背部和尾部肌肉中存在差异性表达,从而影响肌隔组织中肌间骨的骨化,对背部和尾部肌间骨形态发生产生影响。     

草鱼和鲤群体遗传变异的RAPD指纹分析

利用随机扩增多态ＤＮＡ技术对革鱼,兴国红鲤,野鲤的种群内,种群间以及种间的遗传变异亏待进行了定量分析。结果表明;草鱼与鲤的ＲＡＰＤ指纹图谱带型差异显著,草鱼与红鲤和鲤种间的平均带纹相似系数分别为０．２５８３和０．２３９４,遗传距离分别达到０．９３６２和１．２２７７。     

异源四倍体银鲫外周血和精巢的组织学特征

通过比较D 系三倍体银鲫 (Carassius auratus gibelio Bloch) 与异源四倍体银鲫, 我们发现异源四倍体的外周血与精巢组织跟三倍体银鲫存在明显差异。HE 染色结果表明, 异源四倍体银鲫外周血红细胞有明显的分裂倾向。利用流式细胞术对D 系三倍体银鲫与异源四倍体银鲫外周血的DNA 直方图进行比较, 结果表明异源四倍体外周血的DNA 直方图有两个主峰。此外, 我们观察到异源四倍体银鲫精巢的三种类型, 其中Ⅰ型精巢可以产生正常精子, Ⅱ型可观察到精小囊结构, 但不能产生精子, Ⅲ型精巢未发育出精小囊结构。进一步用银鲫Vasa 抗体对精巢切片进行组织免疫荧光共聚焦显微分析, 结果表明, Ⅰ型精巢的生殖细胞完成了减数分裂, 能观察到精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞, 以及大量位于精小管中间的精子细胞和精子; 而Ⅱ型精巢的生殖细胞不能完成第二次减数分裂, 精小囊中存在大量的初级和次级精母细胞, 没有精子细胞产生。研究丰富了对异源四倍体银鲫生物学性状的认识。       

长江水系钱草鱼遗传结构及变异性的RAPD研究

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对长江中游的湖北嘉鱼与江西瑞昌两个地理群体和中游的汉江和湘江两大水系的鲢和草鱼的群体进行了遗传学研究。发现长江水系链的遗传变异要高于草鱼,与现今生物量成反比的反常现象。鲢遗传多样性从大到小的分布是嘉鱼→湘江→瑞昌→汉江。草鱼遗传多样性从大到小的分布是瑞昌→汉江→湘江→嘉鱼,鲢和草鱼的遗传多样性地理分布并不一致。遗传分化指数Gst分别为12.3%和17.5%,表明鲢和草鱼的四个地理群体的遗传分化度较低,可能与地理较近和基因交流频繁有关。     

草鱼Noxa基因克隆及其应答GCRV入侵的表达响应

研究通过获得草鱼Noxa基因(Cinoxa)全长cDNA, 进行序列分析和进化树构建, 使用定量PCR (qPCR)的方法研究其在GCRV刺激下的表达模式。研究发现, 草鱼Noxa基因的蛋白序列与斑马鱼Noxa基因具有高度相似性。通过分析草鱼和斑马鱼的Noxa基因的蛋白三维结构(3D)模型, 研究发现两者具有高度一致的蛋白三维结构模式, 该模型与高等哺乳类中的Bcl-2家族蛋白中C端结构域同源。对Cinoxa在GCRV刺激下的表达模式的研究表明, Cinoxa在GCRV感染后中肾、脾脏和头肾中表达发生显著性变化, 攻毒后24h和120h出现显著上调表达。研究表明草鱼Noxa为斑马鱼Noxa的同源基因, 并且参与了草鱼对GCRV入侵的应答反应, 为深入研究鱼类Noxa应答病毒入侵的功能和转录调控机制奠定了基础。