鳖甲在抗肝纤维化和抗肝癌作用中的研究进展

鳖甲性寒味咸,归肝肾经,能滋阴潜阳,善于软坚散结。张仲景创立的经典方剂鳖甲煎丸方中以鳖甲为主药,具有行气活血、祛湿化痰、软坚消癥的功效。近年来鳖甲及其复方鳖甲煎丸在临床上广泛应用于肝硬化及肝癌的治疗,取得了较好的疗效。在作用机制研究中发现鳖甲的抗肝纤维化作用可能与其对机体炎症环节的影响有关,同时对细胞外基质(ECM)和肝星状细胞(HSC)具有调控作用;在抗肝癌研究中,发现单味鳖甲和鳖甲煎丸可能通过增强小鼠的免疫功能、肝脏保护作用,发挥抑制肝癌细胞生长的作用。本研究对鳖甲及其复方鳖甲煎丸在肝纤维化和肝癌的临床治疗应用,以及实验研究进展做一综述,以期为研究鳖甲在抗肝纤维化和抗肝癌作用中的机制研究,及肝纤维化及肝癌的治疗和预防提供参考。     

长链非编码RNA H19促进肝癌细胞增殖和侵袭

目的:肝癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤,但其发病机制目前仍不明确.虽然长链非编码RNA的异常表达与多种肿瘤的发生密切相关,但在肝癌中的报导尚不多见.因此,本文将探讨长链非编码RNA H19在肝癌组织和正常组织中表达差异,进一步检测其对肝癌细胞增殖和侵袭活性的调控及其分子机制,为开发长链非编码RNA的临床诊断试剂提供实验依据.方法:收集20例肝癌手术患者的癌变组织和20例正常组织,通过real time PCR检测H19的表达差异.在转染或干扰掉该H19后,采用MTT的方法检测HepG2细胞的增殖活性,通过Transwell小室的方法检测HepG2细胞的侵袭活性.结果:real time PCR检测发现H19 mRNA在肝癌组织中高表达,而在正常组织中低表达.过表达H19导致HepG2细胞过度增殖,敲除该lncRNA,细胞增殖和侵袭活性被抑制.结论:H19在肝癌组织中的表达明显高于正常肝组织,并且过表达H19导致肝癌细胞增殖活性增加,而敲除H19会导致肝癌细胞的增殖和侵袭活性明显减弱.该LncRNA在肝癌组织中的过量表达有助于肝癌的临床诊断,同时H19在肝癌的恶性肿瘤生物活性中发挥着重要的作用,因此,H19是一个潜在的治疗肝癌的药物作用靶点,为开发新的抗肿瘤药物提供了新的治疗靶点.     

LncRNA00067110通过靶向Cabyr调控B16-F10细胞增殖、凋亡和黑色素生成

长非编码RNA(lncRNA)是一类转录长度大于200个核苷酸的非编码RNA。现已证明,多个lncRNA是潜在的癌症治疗靶点。LncRNA00067110是从小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和正常黑色素细胞转录物组图谱中发现的差异表达基因。为研究lncRNA00067110是否调控B16-F10细胞的增殖、凋亡和黑色素生成,本文通过LncTar预测和双荧光酶活性验证了钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(Cabyr) 和lncRNA00067110存在靶向关系。通过构建lncRNA00067110的过表达载体,转染B16-F10细胞,经过对B16-F10细胞的转录图谱分析,并对细胞增殖、凋亡和黑色素生成的表型以及相关基因表达变化进行了检测。结果显示,lncRNA00067110靶向Cabyr,在过表达lncRNA00067110的B16细胞中,17个基因呈差异表达。其中,Cabyr的表达被上调,细胞增殖相关基因MEK/ERK/MNK/CREB和黑色素生成相关基因TYR家族成员及CREB的mRNA和蛋白质水平显著被下调,凋亡相关基因AKT和Bcl-2的mRNA水平和蛋白质丰度被上调。进一步通过细胞增殖和凋亡的表型的变化验证了lncRNA00067110的功能。结果提示,lncRNA00067110通过靶向Cabyr,调控相关基因表达,从而抑制B16-F10细胞的增殖和黑色素生成,并诱导黑色素瘤细胞的凋亡,可能成为治疗和抑制黑色素瘤的新的靶点。     

低氧mtDNA3010A/G基因型变异诱导的lncRNA-mRNA共表达网络变化

目的: 分析mtDNA3010A/G变异在急性缺氧条件下的长链非编码RNA(lncRNA)和信使RNA(mRNA)的共表达网络变化,探讨关键lncRNA和mRNA在低氧诱导的基因表达调控中的作用。方法: 筛选线粒体DNA(mtDNA)3010-5178-10400的基因型组合A-C-C和G-C-C,以骨肉瘤细胞经溴化乙锭处理后形成的无线粒体细胞(ρ⁰206细胞)为供体,构建mtDNA3010A和mtDNA3010G基因型融合细胞。经1%O₂处理24 h后,采用lncRNA-mRNA共表达芯片检测两种融合细胞的差异表达lncRNA和mRNA,荧光定量聚合酶链式法验证差异显著的mRNA,运用生物信息学方法构建lncRNA-mRNA共表达网络,预测差异lncRNA的靶基因,并对差异显著的mRNA和预测靶基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组大百科全书(KEGG)预测分析。结果: 经1%O₂处理24 h后,与mtDNA3010G融合细胞相比,mtDNA3010A融合细胞表达上调的lncRNA有688个,超过2倍的有21个,表达下调的lncRNA有1098个,超过2倍的有4个;表达上调的mRNA有1151个,超过2倍的有14个,表达下调的mRNA有539个,超过2倍的有3个。结论: mtDNA3010A/G基因型变异在缺氧条件下能够影响lncRNA-mRNA调控网络的变化,差异表达的lncRNA和mRNA可能在低氧诱导的基因表达调控网络中发挥重要作用,有望成为从线粒体角度调控低氧反应的靶点。     

LncRNA SPRY4-AS1通过糖酵解调控肝癌细胞的增殖与凋亡

长非编码RNAs (lncRNAs)在转录水平和转录后水平均对细胞的多种功能发挥重要的调节作用。大量研究已经表明,lncRNAs在肿瘤细胞的糖代谢过程中发挥了不可忽视的作用。然而,其具体的机制仍需进一步探究。该文研究了lncRNA SPRY4-AS1通过糖代谢调控人肝癌细胞(HepG2细胞和Huh7细胞)体外增殖与凋亡的影响及其相关机制。首先,利用TCGA数据库预测了SPRY4-AS1的表达对肝癌患者生存率的影响。进而通过siRNA或慢病毒载体构建SPRY4-AS1的HepG2细胞或Huh7细胞的低表达株和高表达株探究其机制。并通过CCK-8、流式细胞仪(FCM)、细胞耗氧率(OCR)、Western印迹和荧光定量PCR等方法,分别检测细胞的体外增殖能力、细胞周期变化及凋亡相关蛋白质水平的变化与糖酵解能力的变化,同时也检测了IRS-1、AKT和PI3K磷酸化基因在蛋白质水平的表达量。结果表明,促进lncRNA SPRY4-AS1的表达可以提高肝癌患者的生存能力,并对其机制进一步探究发现:与对照组(si-NC)相比,实验组(si-lncRNA SPRY4-AS1)细胞增殖能力明显增强(P0.05),而在过表达细胞中,细胞增殖能力明显下降(P0.05)。此外,在过表达lncRNA SPRY4-AS1的细胞中,S期细胞所占比例显著减少(P0.05),G_2/M期细胞比例增加(P0.05),Bcl-2基因在蛋白质水平的表达量降低,Cyt c基因在蛋白质水平的表达上升。在低表达lncRNA SPRY4-AS1细胞中,PI3K/AKT信号通路被激活;而过表达细胞中,PI3K/AKT信号通路被抑制。然而,细胞胞外产酸能量增强,HK与PFK的mRNA表达量上升(P0.05),并且酶活显著增强(P0.05)。综上所述,lncRNA SPRY4-AS1可以通过抑制PI3K/AKT信号通路,降低糖酵解水平,导致其凋亡,从而抑制细胞的增殖,延缓肝癌患者的寿命。     

骨桥蛋白通过NF-κB上调钙蛋白酶小亚基1促进肝癌细胞迁移

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)参与调控多种信号途径激活转移相关基因,进而促进细胞迁移.钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit1,Capn4)与肿瘤转移密切相关,在许多肿瘤及其转移组织中高表达.为了探讨OPN促进肝癌细胞迁移的分子机制,应用报告基因检测、RT-PCR、免疫印迹及伤口愈合等方法检测了肝癌细胞中OPN对Capn4的调控作用及其对肝癌细胞迁移的影响.结果显示,在HepG2细胞中过表达OPN后,Capn4的启动子转录活性显著增强,同时mRNA及蛋白质表达水平也明显上调.在HepG2细胞中应用siRNA干扰OPN的表达可导致Capn4启动子转录活性受到明显抑制,同时mRNA及蛋白质表达水平也显著下调.应用核转录因子-κB(NF-κB)的抑制剂PDTC可抑制由过表达OPN导致的HepG2细胞中Capn4的上调.伤口愈合实验显示,OPN可以通过上调Capn4促进肝癌细胞迁移.因此,研究发现,OPN通过NF-κB上调Capn4的表达,进而促进肝癌细胞的迁移,这一发现对进一步阐明肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

JunD的结构功能特征及其在肿瘤发展中的作用

JunD是一种属于多功能激活剂蛋白-1（activating protein-1,AP-1) 家族的转录因子,可以激活或抑制多种靶基因的表达.在生长发育过程中,在各种细胞类型中都呈现出组成性表达.近20年的临床数据及分子生物学研究表明,JunD蛋白的功能受多个复杂过程调控,包括转录控制、转录后调节、蛋白质翻译后修饰及蛋白-蛋白相互作用等.JunD基因表达的精细调控及JunD蛋白与其它蛋白之间的相互作用可调节细胞增殖、分化和凋亡等过程.JunD蛋白活性异常会导致肿瘤、代谢及病毒类疾病的发生.JunD蛋白的转录激活及抑制受1个复杂调控网络调控,在这个网络调节下,JunD蛋白在细胞的生长调控过程中发挥重要作用.本文就JunD基因表达的调控机制及其与肿瘤之间关系的最新研究进展做一综述.     

非编码RNA多维调控网络与肝细胞癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,下称肝癌)是一种全球高发的恶性肿瘤,其生长快、易转移、死亡率高.非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是指由基因组转录的不编码蛋白质的RNA.它们数量巨大,占人类基因组转录产物的90%以上.近年研究发现, ncRNA可以在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达,或者调控蛋白质的定位及活性,进而影响细胞的分化、增殖、死亡、运动等重要活动; ncRNA的失调与疾病的发生发展密切相关.发现肝癌相关的ncRNA并深入研究其调控网络及作用机制将为肝癌的诊断和治疗提供新策略.本文介绍了ncRNA的分类, ncRNA的生成、加工和降解机制, ncRNA的功能网络,并总结了ncRNA在肝癌细胞恶性表型调控中的功能及机制,最后讨论了ncRNA作为诊断标志物和治疗靶点的潜在应用.     

外源E2F和CArG顺式元件对血管平滑肌细胞表型相关基因表达的影响

利用转录因子“诱骗”策略 ,阻断血管平滑肌细胞 (VSMC)表型特异基因和增殖相关基因的反式激活 ,揭示VSMC表型转化和增殖之间的关系 .电泳迁移率改变分析结果表明 ,相当于分化型VSMC特异表达基因共有顺式元件CArG和细胞增殖相关基因共有顺式元件E2F的双股寡核苷酸(ODNs)可分别与从分化型和去分化型VSMC中提取的核蛋白特异性结合 ,形成DNA 蛋白质复合物 .Northern杂交结果显示 ,导入VSMC中的CArGODN可使平滑肌α肌动蛋白 (α actin)表达活性降低 ,肌丝数量减少 ,明显抑制转染细胞的再分化过程 .去分化型VSMC被E2FODN转染后 ,增殖相关基因c myc表达受到抑制 ,细胞增殖速率减慢 ,去分化表型特征减弱 .结果提示 ,E2F和CArG调控元件分别对VSMC增殖和分化起重要调节作用 ,并证实VSMC表型转化与增殖是两个密切相关但不完全相同的细胞事件 .     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.