慢病毒载体系统介导hUC—MSC绿色荧光蛋白和荧光素酶共表达技术体系的建立

目的建立慢病毒载体系统介导的人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶共表达技术体系。方法 GFP和荧光素酶共表达慢病毒载体与相应包装质粒psPAX2和pMD2.G经聚乙烯亚胺介导共转染HEK293T细胞以包装病毒;病毒感染P4代hUC-MSC 12 h后,再行嘌呤霉素筛选24 h,普通光学显微镜观察细胞形态,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,IVIS Kinetic成像系统拍照以观察和记录慢病毒感染后hUC-MSC荧光素酶的表达情况;MTS法行细胞生长曲线作图,同时,普通和实时定量RTPCR法检测细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1的表达。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果慢病毒感染并不会造成体外培养hUC-MSC形态的明显改变,而荧光显微镜和IVIS Kinetic成像系统的观察结果则分别证实,GFP和荧光素酶经慢病毒载体系统的介导可在hUC-MSC中成功地共表达。此外,细胞生长曲线作图结果表明,对照和GFP及荧光素酶共表达慢病毒感染后hUC-MSC的生长增殖速率相仿（P〉0.01）;实时定量RT-PCR法检测结果则显示,与对照慢病毒感染相比,GFP和荧光素酶共表达慢病毒感染后其细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1mRNA表达水平分别是对照组的1.11倍（P=0.130）、0.54倍（P=0.000）和0.78倍（P=0.005）,表明外源GFP和荧光素酶共表达对体外培养的hUC-MSC生长增殖等表型无显著影响。结论慢病毒载体系统可有效介导外源基因在hUC-MSC中的表达;同时,GFP和荧光素酶在hUC-MSC中的共表达也将极大地方便其体内转归的示踪。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的：包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的基因治疗研究。方法：从CCR5Deha32突变个体外周血单个核细胞（PBMC）中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Deha32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm—T载体连接,随后转化EcoliDH5ct,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6／V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP／VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果：克隆出人CCR5Deha32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×10^5TU／mL的重组慢病毒。结论：高滴度含人CCR5Deha32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。     

人BRCA1 干涉慢病毒载体的构建与验证

目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化。结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调。结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础。     

下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。     

copGFP和PuroR双标记基因慢病毒融合表达载体的构建及应用*

目的: 构建具有绿色荧光蛋白(copGFP)和嘌呤霉素抗性基因(PuroR)融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,检测其嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性。方法: 从pCDH-CMV-MCS-copGFP载体中扩增copGFP编码区DNA序列,从pLKO.1载体中扩增Puro^R编码区DNA序列,运用重组PCR方法,扩增copGFP与Puro^R基因融合编码序列并克隆至经BamH Ⅰ+Sal Ⅰ双酶切的pCDH-CMV-MCS-copGFP载体片段中,构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;载体的融合标签序列进行测序确证;将该载体用辅助包装质粒PLP1、PLP2、VSVG在293T细胞中包装成慢病毒后感染肝癌细胞MHCC97H,检测感染细胞对嘌呤霉素的抵抗作用以及绿色荧光蛋白的表达情况;为验证该载体表达外源目的基因的有效性,将Sp1编码区DNA序列插入该载体中包装成慢病毒,用对照及表达Sp1的慢病毒感染肝癌细胞MHCC97H,感染细胞经1 mg/ml嘌呤霉素筛选7 d后获得稳定感染细胞株,提取稳定感染细胞的总RNA及总蛋白,分别运用RT-qPCR和Western blot方法检测Sp1在对照及表达Sp1的慢病毒感染的肝癌MHCC97H细胞中的mRNA和蛋白表达水平的差异。结果: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;该载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,感染细胞同时具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光蛋白特性;将Sp1编码序列插入该载体,包装慢病毒并肝癌细胞,Sp1 的mRNA水平对照细胞相比分别升高3.3倍,蛋白水平升高2.2倍(P＜0.01)。 结论: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,该载体编码的融合双标记基因具有嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性,可高水平表达长片段的目的基因。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

人造血转录因子GATA-1的克隆、表达及其对间质细胞的生物学作用

目的:构建人GATA-1全长过表达载体,对其进行过表达,并初步探讨其在人非造血细胞(人脐静脉内皮细胞、人成纤维细胞)中的生物学作用。方法:以人脐带血cDNA为模板,采用高保真PCR获得GATA-1的CDS序列,连接至pGEM-T Easy载体,构建pBPLV-GATA1慢病毒表达质粒,并对上述载体进行NheⅠ、XbaⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,在293T细胞中进行慢病毒包装,浓缩病毒后,对我们原代分离培养的人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞进行慢病毒感染,采用流式分选对阳性目的细胞进行纯化,阳性细胞扩增后进行Western印迹鉴定;以人包皮成纤维细胞(HFF)为研究对象,在光学及荧光显微镜下观察细胞形态变化情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞表面标志表达情况。结果:双酶切和测序结果表明克隆了1242 bp的人GATA-1全长CDS序列,经Western印迹检测,GATA-1在293T细胞中获得瞬时表达;获得了人GATA-1稳转细胞株,对稳转细胞株的检测表明,GATA-1对HFF细胞增殖具有一定的抑制作用,但对HFF细胞形态及细胞表面标志CD90、CD29的表达无明显影响。结论:构建了人GATA-1慢病毒表达载体及其稳转细胞株,GATA-1蛋白对间质细胞的增殖有一定的抑制作用。     

微小RNA miR-125b真核表达载体的构建及其对细胞增殖的影响

目的:构建微小RNA125b(miR-125b)真核表达载体,研究其过表达后对细胞增殖的影响。方法:以pcDNA3.1(-)-myc-his载体为模板,PCR扩增CMV启动子,克隆入pHRS-1cla-EGFP慢病毒载体,构建pHRS-1cla-CMV-EGFP载体;以从人全血中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-125b序列,将其克隆到pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP慢病毒表达载体;将pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP表达载体瞬时转染入293FT细胞,用实时定量PCR技术对miR-125b在转录水平的表达进行检测,用MTT及Brdu法检测miR-125b过表达后对293FT细胞增殖的影响。结果:构建的pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP真核表达载体经质粒酶切和测序鉴定正确,转染细胞后72h经实时定量PCR检测,成熟miR-125b表达上调约750倍(P0.01),说明其能有效高表达,MTT及Brdu法检测显示细胞增殖受到明显抑制(P0.01)。结论:构建了pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP慢病毒真核表达载体,转染293FT细胞后能高效表达成熟miR-125b,同时证明过表达miR-125b能使细胞的增殖受到非常明显的抑制。     

牛miR-193a基因过表达和抑制的慢病毒构建及初步鉴定

目的:构建牛miR-193a过表达和抑制的慢病毒并进行初步鉴定。方法:根据miRBase数据库中牛miR-193a的前体序列设计引物;以MDBK细胞全基因组为模版,扩增pre-miR-193a和pre-miR-193a inhibitor基因;并克隆至慢病毒载体pLL3.7中;经酶切和测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至HEK-293T细胞中;转染48h后,收集慢病毒并感染MDBK细胞;感染48 h后,观察MDBK细胞中绿色荧光的分布情况,并收集细胞,提取总RNA并合成cDNA,实时定量PCR检测miR-193a表达水平。结果:成功构建了过表达和抑制miR-193a表达的慢病毒;pre-miR-193a慢病毒感染后miR-193a的表达水平显著性增加(约4.55倍);相反,pre-miR-193a inhibitor慢病毒感染后miR-193a表达水平显著性下调(约0.73倍)。结论:该研究成功构建了牛miR-193a过表达和抑制表达的慢病毒,为进一步的miR-193a的功能学研究奠定基础。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。     

MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达

为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。     

慢病毒介导稳定表达MCM7、CDC6细胞株的建立

[目的]构建包装微小染色体维持蛋白7(Mcm7)、细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)过表达慢病毒,并筛选Hep G2和LO2稳定过表达细胞株。[方法]通过PCR获得人的mcm7、cdc6基因,采用双酶切法构建重组慢病毒过表达载体。慢病毒过表达载体与ps PAX2、p MD2. G包装质粒共转染293T细胞后包装出慢病毒。慢病毒感染Hep G2和LO2后,通过有限稀释法筛选获得稳转细胞株,再经q PCR以及Western Blot鉴定过表达效果,FACS检测周期分布。[结果]成功构建并包装出了慢病毒,慢病毒滴度为1. 3×106TU/m L,感染Hep G2和LO2细胞后筛选获得稳转细胞株,并从mRNA和蛋白水平验证,Mcm7稳转株过表达效率超过0. 4倍,Cdc6稳转株过表达效率超12倍,稳转株周期分布与母代细胞没有显著差异(P 0. 05)。[结论]Mcm7、Cdc6稳转株构建成功,稳转株过表达效果明显,Mcm7、Cdc6的稳定过表达没有扰乱细胞周期进程。     

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒/腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定

目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。     

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。