陆川猪FAM134B基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在对陆川猪FAM134B基因进行克隆及生物信息学分析。本研究利用Gen Bank公布的猪序列设计引物,应用RT-PCR扩增得到目的基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了陆川猪FAM134B基因的理化性质与二级结构。结果显示:陆川猪FAM134B基因编码区全长1 107 bp,编码368个氨基酸;陆川猪FAM134B基因与与金华猪(JX854456.1)、牛(KM587693.1)、山羊(KF684947.1)、人(NM_001034850.2)、小鼠(NM_001034851.2)、大鼠(NM_001034912.1)、非洲爪蟾(NM_001126975.1)序列相似性分别为87.80%、87.44%、86.9%、68.47%、67.01%、67.29%、61.44%,结合系统进化树分析,结果表明不同物种FAM134B基因在进化过程中具有高度保守性。通过比较分析发现,陆川猪FAM134B基因CDS序列区比NCBI公布的金华猪FAM134B序列(JX854456.1)多了一段129 bp序列,比预测的猪FAM134B序列(XM_003483804.2)少了一段371 bp,这提示所扩增得到的陆川猪FAM134B基因有可能是另外一种剪接体。本研究成功克隆陆川猪FAM134B基因完整的CDS序列,为今后FAM134B基因在陆川猪的脂肪沉积及脂肪代谢方面的研究提供基础理论。     

巴马小型猪TNF-α基因的克隆与相关生物学信息分析

本研究旨在分析巴马小型猪TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)基因的遗传变异情况。实验采用RT-PCR和克隆的方法成功扩增TNF-α基因的编码区序列,同时对TNF-α基因和相应的蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明,巴马小型猪TNF-α基因编码区全长为699 bp,编码232个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪TNF-α基因(登录号:NM_214022.1)序列进行比对,未发现核苷酸碱基突变;编码的232个氨基酸分子量为25 253.9,理论等电点为5.44,不存在信号肽,但存在跨膜螺旋结构。经过序列相似性分析,巴马小型猪的TNF-α基因与猪、人、马、牛、家犬、绵羊同源性比较结果表明其具有较强的保守性。巴马小型猪的TNF-α基因与野猪的亲缘关系一致。     

陆川猪SOCS3基因克隆及生物信息学分析

细胞因子信号通路抑制因子3(SOCS3)是一类调节机体免疫和神经内分泌功能的生物活性物质。本研究以陆川猪背最长肌cDNA为模板,克隆获得了SOCS3基因编码区序列(CDS)。序列分析结果显示,陆川猪SOCS3基因CDS全长为690 bp,与Gen Bank中公布的长白猪的CDS的同源性为99.9%,并发现存在第70位点的A→G,碱基G为陆川猪所特有,导致苏氨酸突变为丙氨酸。陆川猪SOCS3基因CDS与Gen Bank上已经公布的马、犬、人、牛、大熊猫、河狸、猕猴、小鼠的SOCS3基因CDS进行比对,发现它们的同源性依次为95.5%、95.1%、95.0%、94.3%、94.2%、93.2%、92.5%和90.4%。构建SOCS3基因系统进化树的结果表明,与陆川猪遗传距离最近的是长白猪,最远是小鼠;陆川猪SOCS3蛋白的高级结构中包含有α螺旋、β折叠、无规卷曲和延伸链。本研究为今后探讨SOCS3基因在陆川猪肌肉生长发育、脂肪沉积、抗热应激能力的分子机制提供科学理论依据。     

牛Irak-1基因的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆提供了一种利用基因组数据库克隆新基因全长cDNA序列的策略。利用小鼠Irak-1基因编码序列(NM_008363)为种子序列进行电子克隆获得了牛Irak-1基因完整编码序列。然后,用生物信息学方法分析了该基因的结构,微卫星位点,密码子偏性和氨基酸的同源性等。结果表明:该基因cDNA全长2 645bp,无内含子,最大开放阅读框2 157bp,编码718个氨基酸,与小鼠的同源性为77%。     

陆川猪脂联素基因的克隆及生物信息学分析

脂联素(AdipoQ)是脂肪组织分泌的一种有活性的物质,其在调节脂肪代谢、脂肪沉积以及对抗胰岛素抵抗、炎症反应、动脉粥样硬化等方面发挥着重要的作用。本研究以Gen Bank家猪脂联素基因序列为参考,利用Oligo7自行设计一对引物,以广西陆川猪皮下脂肪组织cDNA为模板,克隆获得了AdipoQ基因编码区序列(CDS)。序列分析结果显示,陆川猪AdipoQ基因CDS区长为732 bp,可编码242个氨基酸,分子量为26 400.7 Da。信号肽预测显示陆川猪Adipo Q蛋白含有编码17个氨基酸的信号肽,这一预测结果也印证了前人的研究,进一步证实了脂联素为一种分泌蛋白的说法。与GenBank已公布的长白猪(DQ164208.1)、大白猪(DQ164207.1)、广西巴马小型猪(JF730719.1)、梅山猪(DQ164209.1)这四种猪AdipoQ基因CDS区进行序列比较,发现不同猪种间略有差异,而同源性均达98.9%以上。本研究还对克隆获得的陆川猪AdipoQ基因编码蛋白进行了高级结构预测,为后期研究AdipoQ基因调控陆川猪脂肪沉积和肌肉生长发育的分子机制提供理论基础。     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.     

从江香猪λ1干扰素基因的克隆及序列分析

[目的]对从江香猪λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)基因进行扩增、克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从淋巴细胞中扩增IFN-λ1基因CDS区并进行克隆和生物信息分析。[结果]从江香猪IFN-λ1基因CDS全长576 bp,共编码191个氨基酸,其分子式为C949H1543N277O270S7,相对分子质量21.38 k Da;该蛋白等电点为9.42,为亲水性蛋白。从江香猪IFN-λ1含有丰富的二级结构,以α-螺旋(64.40%)和无规卷曲(25.65%)为主,蛋白质三级结构中主要以α-螺旋为主,同源性及系统进化树分析结果表明从江香猪与野猪IFN-λ1核苷酸同源性最高(为100%),亲缘关系最近。[结论]从江香猪IFN-λ1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其抗病毒功能奠定了基础。     

拟黑多刺蚁脱皮激素受体编码基因的克隆及系统发育分析

为了研究脱皮激素受体在拟黑多刺蚁发育中的功能,本项目采用逆转录PCR方法从拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)中克隆到脱皮激素受体编码基因PvEcR全长序列,对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。从拟黑多刺蚁中克隆到脱皮激素受体蛋白编码基因1 737bp的全长序列,该序列编码578个氨基酸,预测的蛋白分子量大小为63.098×103,理论等电点为7.41。NCBI蛋白质数据库中进行Blast搜索表明,拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白PvEcR存在至少6类保守结构区域,主要为DNA结合位点、配体结合位点和激活因子识别位点。PvEcR蛋白序列磷酸化位点预测共揭示48个可能的磷酸化位点。PvEcR与其他昆虫脱皮激素受体蛋白在氨基酸序列上同源性高达70%以上。基于脱皮激素受体蛋白氨基酸序列构建的系统发育树表明,几乎所有蚁类脱皮激素受体形成一个大分支,其中拟黑多刺蚁与佛罗里达弓背蚁表现出最近的亲缘关系。     

木薯果胶甲基酯酶抑制因子MePMEI1的生物信息学分析

为探讨木薯MePMEI1的分子结构特征。通过PCR扩增和测序技术及生物信息学分析工具对木薯MePMEI1基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明木薯MePMEI1基因编码区全长609 bp,编码202个氨基酸残基;MePMEI1基因编码蛋白分子量21.78 k D,理论等电点(pI)约为5.51;生物信息学预测发现,木薯MePMEI1蛋白是稳定的亲水蛋白;具有跨膜区为分泌蛋白;含有1个PMEI结构域,1个糖基化位点,31个磷酸化位点;二、三级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该蛋白的生物功能可能与细胞被膜、酶和生长因子等相关。木薯MePMEI1基因的生物信息学分析为进一步研究其遗传特性和生理生化机制提供了理论依据。     

家鸡G蛋白偶联受体78基因的克隆与组织表达图谱分析

G蛋白偶联受体(GPCR)是一大类膜受体超家族,参与了机体几乎所有的生理过程,是一类重要信号分子受体。GPR78作为GPCR超家族的成员之一,属于孤儿型受体。目前,在脊椎动物中,针对该基因结构与功能的研究极少。本研究以家鸡为动物模型,通过RT-PCR方法克隆了GPR78基因的编码区序列,并探究了该基因在家鸡各组织中的表达情况。结果显示:家鸡GPR78基因编码区全长为1020 bp,含3个外显子,可编码1个长为339个氨基酸的7次跨膜受体;该基因在家鸡脑各功能区及垂体中高表达,而在其他外周组织中均不表达。本研究为后续探究GPR78基因在家鸡中的生理功能奠定基础。     

屯昌猪MYLPF基因序列分析及其组织表达量检测

为获得屯昌猪MYLPF基因的CDS区序列并分析其分子结构特征,研究屯昌猪、杜洛克猪以及其杂交F1代猪不同组织中的MYLPF mRNA表达水平,本研究以GenBank上公布的猪MYLPF基因序列(登录号:NM_001006592)为参考设计引物,通过RT-PCR扩增、测序获得屯昌猪MYLPF基因CDS区.结果显示:该基因CDS区长度510 bp,编码169个氨基酸,在CDS区存在33 G＞T的同义突变;该基因编码产物既没有跨膜结构,也不存在信号肽,属于非分泌型蛋白,主要在细胞质中发挥作用,预测存在1个潜在的糖基化位点和9个磷酸化位点,α螺旋区域在预测的二级结构中占比最大.荧光定量PCR检测结果显示MYLPF基因在屯昌猪背最长肌中表达量最高,屯昌猪背最长肌中MYLPF mRNA的表达量均显著高于杜洛克猪及其杂交F1代猪.本研究为探明MYLPF基因对猪肌内脂肪的影响提供了分子理论依据.     

家鸡G蛋白偶联受体161的基因克隆、分子进化和组织表达

G蛋白偶联受体161(GPR161)是G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员,在哺乳动物晶状体发育调节和神经胚形成中具有重要作用。近年来研究发现该蛋白罕见地拥有类似支架蛋白的结构特征,暗示其信号转导机制不同于其他G蛋白偶联受体。本研究以家鸡Gallus gallus为动物模型,探究GPR161基因序列信息、分子遗传进化关系以及其组织表达图谱。家鸡GPR161基因编码区序列全长1 566 bp,编码具521个氨基酸的前体蛋白。序列分析显示,家鸡GPR161基因编码区与人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、斑马鱼Danio rerio的氨基酸相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。分子进化遗传分析结果显示,GPR161基因在家鸡与斑马鱼的进化关系比家鸡与人或小鼠都更为疏远。利用荧光定量PCR探究家鸡GPR161基因在各组织的表达分布,结果显示,家鸡GPR161基因mRNA在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高表达。本研究是鸟类中关于GPR161基因的首次报道,研究结果为进一步探究GPR161基因在鸟类中的生理效应提供参考。     

乌金猪FTO基因的克隆和表达分析

目的:克隆乌金猪脂肪和肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS),分析其序列组成特征及在乌金猪不同组织中的表达情况。方法:采用反转录PCR方法从乌金猪脂肪组织中克隆FTO基因CDS,利用生物信息学方法分析其序列组成特征;采用实时PCR方法分析乌金猪FTO基因mRNA在不同组织中的表达情况。结果:克隆的FTO基因全长1518 bp(已提交至GenBank数据库,登录号为JQ031263),编码由505个氨基酸残基构成的蛋白,推测的相对分子质量为58.16×103,等电点为5.18;乌金猪与牛、羊、人和大鼠的FTO蛋白的氨基酸序列同源性分别为91%、90%、89%和83%;进化树分析显示,推测的乌金猪FTO蛋白的氨基酸组成与牛、羊的亲缘性较近,其次是人、大鼠;推测的氨基酸组成中无跨膜区,无信号肽,为亲水蛋白;分析发现该蛋白有22个磷酸化修饰位点,包括10个丝氨酸蛋白激酶磷酸化位点、7个苏氨酸蛋白激酶磷酸化位点、5个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点,200、246、302位氨基酸残基有糖基化位点;二级结构预测发现该蛋白共有201个螺旋、33个伸展链和271个卷曲结构;实时PCR检测的组织表达谱表明,FTO基因mRNA在乌金猪肝脏组织中的表达量最高,在脂肪、肾、脾中也有大量表达,在心脏、肌肉中的表达量最少。结论:为深入探讨乌金猪FTO基因的生物学功能奠定了重要基础。     

牛卵巢PRSS35基因CDS序列分析

为测定牛卵巢丝氨酸蛋白酶35 (PRSS35)的CDS序列并进行生物信息学分析。试验根据NCBI上已公布牛PRSS35基因的mRNA序列设计特异性引物,使用RT-PCR技术扩增牛卵泡中PRSS35的CDS序列。结果显示,牛PRSS35基因CDS区序列全长为1 239 bp,共编码412个氨基酸,PRSS35与其他10个物种的同源序列相似性较高,且该蛋白具有一个长度为20个氨基酸的信号肽,具有11个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点,以及3个磷酸化位点,并发现有一个典型的Tryp_Spc结构域,即胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。为进一步研究该基因及其编码蛋白在卵泡发育过程中所起的作用提供了一定的理论依据。     

水稻OsUVR8基因电子克隆及生物信息学分析

[目的]获得水稻Os UVR8基因的编码区序列,并进行生物信息学分析。[方法]以拟南芥UVR8蛋白的氨基酸序列作为查询探针,用电子克隆的方法获得Os UVR8基因的编码区序列;用生物信息学软件对Os UVR8蛋白进行预测和分析。[结果]Os UVR8基因有13个外显子,编码区序列长1 764 bp,编码587个氨基酸。Os UVR8蛋白分子量为62132.7 Da,理论等电点为5.87,含有41个芳香族氨基酸,比较稳定,为亲水性蛋白。无规则卷曲是主要的二级结构,其次是延伸链。位于细胞内叶绿体、线粒体之外的区域。具有9个RCC1重复。有35个磷酸化位点,19个O-β-葡萄糖糖基化位点,6个Yin-Yang位点。三级结构与拟南芥UVR8蛋白三级结构相似。[结论]获得了水稻Os UVR8基因的编码区序列并进行了生物信息学分析。     

广西巴马小型猪Neuritin基因克隆与生物信息学分析及真核表达载体的构建

本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuritin基因编码142个氨基酸,其中含有2个磷酸化位点和2个跨膜信号结构以及1个结构保守域。通过双酶切技术成功获得重组质粒pEGFP-N1-Neuritin并转染到N2a细胞中,在24 h拍照发现N2a细胞发出荧光,证明Neuritin真核表达载体构建成功。     

家鸡G蛋白偶联受体85基因的结构、序列与组织表达分析

G蛋白偶联受体(GPCR)超家族是细胞膜上广泛存在的一类受体,是细胞跨膜信号转导的一类重要受体分子,参与许多生理过程调节。它们中仍有很多至今尚未找到内源性配体,这类受体被称为孤儿型受体。G蛋白偶联受体85(GPR85)是GPCR超家族中孤儿型受体的一员。目前,在非哺乳类脊椎动物中,针对GPR85的研究极少。本研究以家鸡Gallus gallus domesticus为模型,通过反转录PCR和RACE-PCR等方法从脑中克隆到GPR85基因的cDNA全长序列,揭示其基因结构,并用实时荧光定量PCR(qPCR)方法探究了该基因在家鸡各组织中的表达情况。结果显示:家鸡GPR85基因位于1号染色体上,由2个外显子组成,其编码区位于第2个外显子上,长为1 113 bp,可编码1个370个氨基酸的7次跨膜受体蛋白。家鸡GPR85与其他脊椎动物(人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、大鼠Rattus norvegicus、热带爪蟾Xenopus tropicalis和斑马鱼Danio rerio)的GPR85具有高度的氨基酸序列一致性(>93%)。qPCR分析发现,GPR85基因mRNA在家鸡全脑、垂体、肾上腺、精巢中有较高表达,而在所检测的其他外周组织中表达极低。本研究首次揭示了家鸡GPR85基因的结构与表达特征,为后续探究GPR85基因在家鸡等非哺乳类中的生理功能奠定基础。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

油菜花粉发育相关基因RALFbn的克隆与表达分析

根据美国NCBI数据库中快速碱化因子(RALF)类基因序列的已知信息,克隆了油菜的快速碱化因子基因RALFbn,对其核酸序列及预测蛋白进行了生物信息学分析,并在油菜多种组织内观测其表达情况.结果表明:(1)经克隆获得油菜RALFbn基因的cDNA序列全长为510 bp,无内含子,编码79个氨基酸.(2)生物信息学分析发现,油菜RALFbn蛋白具有RALF类蛋白保守的“YIXY”区和4个保守的半胱氨酸残基,并且含有N豆蔻酰化位点、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、和酪氨酸激酶磷酸化位点等多个生物活性位点,说明该蛋白在油菜中潜在的生理调节能力较为活跃.(3) RT-PCR检测RALFbn基因在油菜生殖器官中的表达结果发现,RALFbn主要在油菜雄蕊中表达,而在雌蕊、花瓣和萼片中没有表达.提示RALFbn基因极可能与油菜雄蕊中花粉的发育相关.