人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

亲和层析纯化HepG_2细胞分泌的PAI－1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性６．１×１０４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡＩ－１活性。用ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析进一步纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯的糖基化ＰＡＩ－１。     

亲和层析纯化HepG2细胞分泌的PAI—1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性为６．１×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０＾４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡ     

利用PCR方法鉴定甲醇酵母转化子的表型

本文以含外源基因的甲醇酵母表达载体ｐＰＩＣ９／Ｅ２Ｆ－１－ＤＢ质粒ＤＮＡ电转化甲醇酵母ＧＳ１１５,小规模抽提所得转化子的总ＤＮＡ,并以其为模板,以乙醇氧化酶（ＡＯＸ１）５’端序列和３’端的ＴＴ序列为引物,进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物走０．８％Ａｇａｒｏｓｅ电泳,通过对ＰＣＲ产物的电泳带型分析,鉴定出甲醇酵母转化子的表型,即Ｍｕｔ＾＋或Ｍｕｔ＾ｓ。这一鉴定结果为转化子的诱导表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图     

用国产微孔玻璃珠初步纯化人u-PA

用国产微孔玻璃珠从ＣＤ－１工程细胞株培养上清中纯化ｕ－ＰＡ,摸索了微孔玻璃珠结合ｕ－ＰＡ的条件和洗脱方法,比较了硫酸铵线性梯度洗脱或２５％乙二醇洗脱ｕ－ＰＡ活性的结果,最后确定洗脱的条件为０．２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、１～２ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ９．３。经此一步纯化,ｕ－ＰＡ比活性达到１５３２９ＩＵ／ｍｇ,回收率７８％,还原条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分子量为５２×１０３的单链ｕ－ＰＡ占７４％。     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔＰＡｃＤＮＡ５′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥＹ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔＰＡｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔＰＡ的活性。Ｍｕｔｓ表型菌表达产物活性最高为２５００ＩＵ／ｍｌ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达产物具有天然ｔＰＡ分子的免疫原性。     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ５＇端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥ－Ｙ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔ－ＰＡ的活性。Ｍｕｔ＾ｓ表型菌表     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

重组尿激酶型纤溶酶原激活物受体在酵母系统中的表达及鉴定

构建截断型可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（ｕ－ＰＡＲ）的原核及酵母表达质粒并分别在大肠杆菌和Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中高效表达．利用ＰＣＲ扩增截断型可溶性ｕ－ＰＡＲｃＤＮＡ片段,并分别连入酵母及原核表达载体中,构建成表达质粒．后者经诱导表达的蛋白被用于免疫家兔,获得抗ｕ－ＰＡＲ的抗血清,用于对酵母表达产物的鉴定．前者在甲醇的诱导下表达,产物分泌至培养液中．结果表明,原核表达的ｕ－ＰＡＲ蛋白免疫家兔后获得高效价的抗血清,利用此抗血清所作Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实酵母表达蛋白具有ｕ－ＰＡＲ的免疫原性,表观分子量４０ｋＤ左右．Ｍｕｔ－表型在第５ｄ为最高（２．５μｇ／ｍｌ）,Ｍｕｔ＋表型在第４ｄ为最高（７．５μｇ／ｍｌ）．因此,构建的可溶性ｕ－ＰＡＲ表达质粒在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母细胞获得表达,为进一步竞争拮抗受体功能的研究奠定了基础．     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ,与ｐＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达,重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质,比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质,得率为１９．２％．     

Protein expression and purification of human Zbtb7A in Pichia pastoris via gene codon optimization and synthesis

Human Zbtb7A was proved to be an important molecular switch in oncogenesis. However, it is difficult to obtain its protein expression in prokaryotic system, due to high G+C content and rare codons in zbtb7a gene. Therefore, to further research the function and application of this protein, we optimized its coding sequence according to the codon bias of Pichia pastoris, synthesized the sequence with two-step PCR and confirmed the accuracy by DNA sequencing. The assembled fragment was introduced into P. pastoris expression vector pPIC9K and the resultant plasmid pPIC9K-zbtb7a-his(6) was transformed into the P. pastoris strain GS115 by electroporation. The products of the transformants induced by methanol were analyzed by 10% SDS-PAGE and identified by Western Blot assay. The expression conditions of the selected transformant were optimized. Additionally, a two-step purification protocol was applied to purify the recombinant protein. The results showed that the synthetic coding sequence of human Zbtb7A was successfully obtained and inserted into pPIC9K vector. Human Zbtb7A protein was expressed in P. pastoris and identified by western blot. The optimal conditions for its expression in P. pastoris were under a final concentration of 1% methanol and a time-course of 4d. Through the two-step purification, Zbtb7A protein was purified in high purity and its production reached up to as high as 18 mg/L. These results indicated that an effective procedure for expressing and purifying human Zbtb7A in P. pastoris was established.     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

Expression of glycosylated haloalkane dehalogenase LinB in Pichia pastoris

Heterologous expression of the bacterial enzyme haloalkane dehalogenase LinB from Sphingomonas paucimobilis UT26 in methylotrophic yeast Pichia pastoris is reported. The haloalkane dehalogenase gene linB was subcloned into the pPICZalphaA vector and integrated into the genome of P. pastoris. The recombinant LinB secreted from the yeast was purified to homogeneity and biochemically characterized. The deglycosylation experiment and mass spectrometry measurements showed that the recombinant LinB expressed in P. pastoris is glycosylated with a 2.8 kDa size of high mannose core. The specific activity of the glycosylated LinB was 15.6 +/- 3.7 micromol/min/mg of protein with 1,2-dibromoethane and 1.86 +/- 0.36 micromol/min/mg of protein with 1-chlorobutane. Activity and solution structure of the protein produced in P. pastoris is comparable with that of recombinant LinB expressed in Escherichia coli. The melting temperature determined by the circular dichroism (41.7+/-0.3 degrees C for LinB expressed in P. pastoris and 41.8 +/- 0.3 degrees C expressed in E. coli) and thermal stability measured by specific activity to 1-chlorobutane were also similar for two enzymes. Our results show that LinB can be extracellularly expressed in eukaryotic cell and glycosylation had no effect on activity, protein fold and thermal stability of LinB.     

诺卡氏菌腈水合酶基因在重组毕赤酵母中的表达

为从基因水平上改造腈水合酶,进行了诺卡氏菌腈水合酶基因的外源表达研究。在重组大肠杆菌表达系统内,腈水合酶的α亚基几乎不能正常表达,在重组E. coli BL21(DE3) (pET32aNHBAX)中,腈水合酶活性仅为0.04U/mg。构建重组毕赤酵母表达质粒pPIC3.5kNHBAX,采用电穿孔转化法将其转入宿主菌P. pastoris GS115中,经过菌株培养和腈水合酶的诱导表达,筛选获得了优选菌株P. pastoris NH4。对P. pastoris NH4的细胞培养和腈水合酶的诱导表达条件进行优化,结果表明,重组腈水合酶在毕赤酵母中的表达水平可以达到0.52U/mg,但不能稳定积累。     

来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表达及性质的比较分析

高效表达高比活木聚糖酶是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成本的有效途径。将橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis) A1的高比活木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组酵母,在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,且表达产物具有生物学活性。在3L发酵罐中蛋白表达量约14mg/mL, 酶活性(效价)为1200IU/mL。SDSPAGE分析表明,表达的木聚糖酶XYNBa为糖基化蛋白, 分子量为31kD, 经脱糖基化处理得到21kD 的XYNBb, 与橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB大小一致。通过对XYNB、XYNBa及XYNBb酶学性质的比较发现：三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明：酶解产物的主要成分为木二糖、木三糖和木四糖,占总糖含量的95%以上。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定

The recombinant human ciliary neurotrophi factor(hCNTF)expressed in E.coli aggregatedas inclusion bodies and refolding procedure was necessary to obtine the active protein.To overcome the disadvantage,we cloned hcntf gene into yeast expression plasmid pPIC9K and collected the plasmid pPIC9K-hcntf.Plasmid pPIC9K-hcntf was transformed into yeast Pichia pastoris GS115,and screened on G418-SD plates.The transformants with high copies of hcntf gene were inoculated into BMMY media and induced with 0.5% methanol.The recombinant hCNTF was secreted into the media.The amount of hCNTF in the supernatant was about 10 mg/L when incubated in the conical flasks and reached up to 60 mg/L under fed-batch condition in 15 L fermentator.The recombinant hCNTF expressed in E.coli was renatured as the control.The neonatal rat dorsal root ganglion assay showed that proteins expressed in both systems have the activity of promoting the growth of neuron axons.The phenomenon can be observed with only 3 μg hCNTF expressed in yeast present,which indicates that hCNTF was successfully expressed in Pichia pastoris and has a relatively high activity.     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。