CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术, 与ZFNs和TALENs相比, CRISPR/Cas系统更简单, 并且更容易操作。文章重点介绍了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理及这一技术在基因组定点修饰中的应用, 剖析了该技术可能存在的问题, 展望了CRISPR/Cas系统的应用前景, 为开展这一领域的研究工作提供参考。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用。简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考。     

新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas系统几乎存在于所有的细菌和古菌中,是用来抵御外来病毒和噬菌体入侵的获得性免疫防御机制。2012年起CRISPR/Cas9被改造为基因编辑工具,并衍生出一系列高效、便捷的基因编辑工具,迅速在基础理论、基因诊断和临床治疗等研究领域中得到广泛应用。然而,CRISPR/Cas9也存在细胞毒性、脱靶效应和基因插入困难等一些亟待解决的问题,在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。Cpf1是2015年报道的一种新型CRISPR效应蛋白,具有许多与Cas9不同的特性,有利于克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。本文综述了近两年来对CRISPR/Cpf1的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及其在畜禽遗传改良中的应用前景

广泛存在于细菌和古细菌中的CRISPR/Cas系统是通过介导外源DNA降解来实现抵抗病毒和外源DNA入侵的一种适应性免疫保护机制,也是新近发展起来的基因组定点编辑技术。从基本结构、作用机制、分类、运用等方面详细地介绍了CRISPR/Cas系统,并分析了该技术在畜禽遗传改良中的运用前景。     

临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布及其与毒力基因的关系

【目的】了解临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布特征并分析其与毒力基因的关系。【方法】以聚合酶链式反应(PCR)方法,采用10对引物分别对57株临床分离志贺菌中CRISPR1、cas2-cas1、cas6e-cas5、cas7、cse2、cse1-cas3基因和毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA进行检测。对CRISPR1的PCR结果进行测序,并用CRISPR finder在线软件对CRISPR1基因座进行分析。通过卡方检验初步分析CRISPR/Cas系统与毒力基因的关系。【结果】测序结果显示,CRISPR1基因座中间隔序列数目较少且在不同菌株间一致性较高;57株志贺菌中,84.2% (48/57)的志贺菌中可检测到CRISPR/Cas系统,其中68.8% (33/48)的志贺菌中cas6e-cas5基因或(和) cse2基因中发现插入序列;毒力基因ipaH、ial、virA、ipaBCD的检出率依次为100%、100%、98.2%和87.7%;毒力基因ipaBCD的阳性率与活性CRISPR/Cas系统的分布无关(P>0.05)。【结论】CRISPR/Cas系统广泛存在于临床分离志贺菌中;部分cas基因中有插入序列;并未发现志贺菌中活性CRISPR/Cas系统与毒力基因的分布有关。     

基于CRISPR/Cas技术的核酸检测研究进展

由成簇、规则间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于多数细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可识别并结合外源入侵的核酸分子,之后Cas蛋白的切割活性被激活,能够对入侵的核酸分子进行切割使其降解。利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性,将其应用于核酸检测中,为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。本文介绍了CRISPR/Cas系统的发展、作用机制等,对多样化的Cas蛋白在核酸检测中的代表性应用研究进行总结,进一步讨论了CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中存在的优缺点,并对未来研究进行了展望,为基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法在病原微生物的检测中提供参考和依据。     

基于全基因组序列的弯曲菌特征分析

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲菌(Campylobacter coli)是引起人类腹泻的主要致病菌。传统生化方法在鉴定弯曲菌时存在步骤多、耗时长、通量低等问题。本研究通过利用生物信息学方法对弯曲菌全基因组进行序列、基因注释、耐药基因、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等分析,挖掘能够有效区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的高分辨力特征。实验结果表明,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在基因组序列长度、GC含量、基因数量、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等方面存在显著差异。同时,研究还发现了一段在空肠弯曲菌基因组中广泛存在的高分辨力CRISPR重复序列。这些特征可用于构建能够准确鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的生物信息学方法。     

CRISPR/Cas系统的概述及其在干扰基因表达研究中的应用及存在的问题

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas系统是源于原核生物的一种获得性免疫防御系统,与Cas蛋白协同作用保护细菌等免受病毒或者质粒的二次感染,广泛存在于细菌和古细菌中。科学家们通过改造CRISPR/Cas系统,使其成为一种新型的基因编辑工具。最近,科学家们又通过突变Cas9这个核酸酶的切割活性区域,使其成仍可结合到特定的核酸序列上,但却失去核酸切割活性的d Cas9(dead Cas9)蛋白,利用这个空间位阻效应达到抑制基因表达的效果,实现基因的沉默。这就是利用CRISPR系统干扰基因表达基本原理。本文主要综述CRISPR/Cas系统的结构、种类、作用机制及其在干扰基因表达中的应用和存在的问题。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)协同其相关蛋白Cas组成了细菌和古细菌的获得性免疫系统。利用该系统可以对外来某一特定单链或双链DNA实施高度特异性沉默或降解的特性,近年来对基因组进行精确定点编辑的CRISPR/Cas系统迅速发展。着重介绍了CRISPR/Cas系统的研究历史、结构、分类及作用机制,并分析讨论了现阶段以Cas9为核心的Ⅱ型系统在应用方面存在的问题及前景。     

CRISPR/Cas系统与结核病防控新措施相关性研究

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB,以下简称结核杆菌)感染引起的结核病仍然是严重影响人类健康全球性重大传染病。全球约1/4人口是结核杆菌的潜伏感染者。2019年,世界卫生组织(Worldhealthorganization,WHO)报道全球约150万人死于结核病。深入研究结核杆菌生物学有望为结核病防控提供新工具。成簇规律性间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromic repeats,CRISPR)/Cas是细菌免疫系统的重要成分,在结核杆菌等分枝杆菌中也广泛存在,同时,也是分枝杆菌基因编辑的重要工具。本文结合课题组研究工作,综述了结核杆菌III-A型CRISPR/Cas系统各组分的生物学功能以及与致病的相关性,CRISPR/Cas编辑工具在诊断治疗耐药结核杆菌和结核病防控新措施中的进展。     

鞭毛介导的空肠弯曲菌氧应激机制研究进展

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是世界范围流行的食源性人兽共患病原菌,是革兰氏阴性微需氧菌。其对氧气、温度、pH和胆汁酸盐等环境条件极其敏感,在环境传播和宿主定殖过程中会遭受许多不利条件,包括致命的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),因此,抵抗活性氧自由基是空肠弯曲菌进化的一种重要策略。空肠弯曲菌为抵抗氧应激进化出了多种响应机制,其中,鞭毛及其介导的运动力也参与氧应激。本文对国内外有关空肠弯曲菌氧应激研究进展及鞭毛介导的氧应激机制进行综合阐述,以期为进一步完善空肠弯曲菌氧应激调控系统奠定基础,并为弯曲菌源头防控提供思路。     

In Vivo Protein Interactions and Complex Formation in the Pectobacterium atrosepticum Subtype I-F CRISPR/Cas System

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated proteins (Cas; CRISPR associated) are a bacterial defense mechanism against extra-chromosomal elements. CRISPR/Cas systems are distinct from other known defense mechanisms insofar as they provide acquired and heritable immunity. Resistance is accomplished in multiple stages in which the Cas proteins provide the enzymatic machinery. Importantly, subtype-specific proteins have been shown to form complexes in combination with small RNAs, which enable sequence-specific targeting of foreign nucleic acids. We used Pectobacterium atrosepticum, a plant pathogen that causes soft-rot and blackleg disease in potato, to investigate protein-protein interactions and complex formation in the subtype I-F CRISPR/Cas system. The P. atrosepticum CRISPR/Cas system encodes six proteins: Cas1, Cas3, and the four subtype specific proteins Csy1, Csy2, Csy3 and Cas6f (Csy4). Using co-purification followed by mass spectrometry as well as directed co-immunoprecipitation we have demonstrated complex formation by the Csy1-3 and Cas6f proteins, and determined details about the architecture of that complex. Cas3 was also shown to co-purify all four subtype-specific proteins, consistent with its role in targeting. Furthermore, our results show that the subtype I-F Cas1 and Cas3 (a Cas2-Cas3 hybrid) proteins interact, suggesting a protein complex for adaptation and a role for subtype I-F Cas3 proteins in both the adaptation and interference steps of the CRISPR/Cas mechanism.     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

基于CRISPR/Cas的分子诊断传感器在非核酸分子诊断中的应用

CRISPR/Cas不仅是一种重要的基因编辑工具,而且还是一种有效的分子诊断工具。目前基于CRISPR/Cas建立了一系列的分子诊断传感器系统,广泛应用于核酸、非核酸等检测过程中。与应用较广泛的核酸分子诊断传感器系统相比,基于CRISPR/Cas的非核酸检测系统目前尚未见系统性综述,因此本文围绕基于CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13建立的两大类非核酸分子传感器诊断系统的基本特征、工作流程及其检测原理等进行了全面综述,期望能为CRISPR/Cas分子诊断系统在体外诊断中的应用提供依据。     

Target-specific mutations efficiency at multiple loci of CRISPR/Cas9 system using one sgRNA in soybean

Soybean has a palaeopolyploid genome with nearly 75% of the genes present in multiple copies. Although the CRISPR/Cas9 system has been employed in soybean to generate site-directed mutagenesis, a systematical assessment of mutation efficiency of the CRISPR/Cas9 system for the multiple-copy genes is still urgently needed. Here, we successfully optimize one sgRNA CRISPR/Cas9 system in soybean by testing the efficiency, pattern, specificity of the mutations at multiple loci of GmFAD2 and GmALS. The results showed that simultaneous site-directed mutagenesis of two homoeologous loci by one sgRNA, the mutation frequency in the T0 generation were 64.71% for GmPDS, 60.0% for GmFAD2 and 42.86% for GmALS, respectively. The chimeric and heterozygous mutations were dominant types. Moreover, association of phenotypes with mutation pattern at target loci of GmPDS11 and GmPDS18 could help us further demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can efficiently generate target specific mutations at multiple loci using one sgRNA in soybean, albeit with a relatively low transformation efficiency.

     

酿酒酵母中基于CRISPR/Cas9工具的基因编辑与代谢调控研究进展

CRISPR/Cas9系统已广泛用于各种生物体的基因编辑和代谢工程。本文综述了CRISPR/Cas9在酿酒酵母中的基本原理和实际应用。首先总结了CRISPR/Cas9技术的发展历史、酿酒酵母基因组中基因缺失和多DNA片段插入的成功案例。这一先进的系统减少了劳动力,增强了对分子遗传学的理解,加速了微生物工程的发展。其次总结了基于CRISPR/Cas9的系统在生产高附加值化学品和提高酿酒酵母耐应激性方面的研究进展。该综述对酿酒酵母的遗传和合成生物学研究具有重要的参考价值。     

Increased efficiency of targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in plants using heat stress

The CRISPR/Cas9 system has greatly improved our ability to engineer targeted mutations in eukaryotic genomes. While CRISPR/Cas9 appears to work universally, the efficiency of targeted mutagenesis and the adverse generation of off‐target mutations vary greatly between different organisms. In this study, we report that Arabidopsis plants subjected to heat stress at 37°C show much higher frequencies of CRISPR‐induced mutations compared to plants grown continuously at the standard temperature (22°C). Using quantitative assays relying on green fluorescent protein (GFP) reporter genes, we found that targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis is increased by approximately 5‐fold in somatic tissues and up to 100‐fold in the germline upon heat treatment. This effect of temperature on the mutation rate is not limited to Arabidopsis, as we observed a similar increase in targeted mutations by CRISPR/Cas9 in Citrus plants exposed to heat stress at 37°C. In vitro assays demonstrate that Cas9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) is more active in creating double‐stranded DNA breaks at 37°C than at 22°C, thus indicating a potential contributing mechanism for the in vivo effect of temperature on CRISPR/Cas9. This study reveals the importance of temperature in modulating SpCas9 activity in eukaryotes, and provides a simple method to increase on‐target mutagenesis in plants using CRISPR/Cas9.