海南捕鸟蛛毒素—Ⅳ对大鼠背根神经节细胞钠通道的抑制影响

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ（HNTX-Ⅳ）是从中国捕鸟蛛Seleconosmia hainana粗毒中分离得到的一种肽类神经毒素,在成年大鼠背根神经节（DRG）细胞上观察了该毒素对电压门控钠通道的影响。在全细胞膜片钳条件下,HNTX-Ⅳ能明显抑制哺乳动物神经性河豚毒敏感型（TTX-S）钠电流,但不影响河豚毒不敏感型（TTX-R）钠电流,HNTX-Ⅳ对DRG细胞TTX-S钠电流的抑制作用具有浓度依从性。其有效半抑制浓度（IC50）为44.6nmol/L。该毒素不影响DRG钠电流的激活与失活时间特征,但能导致钠通道的半数稳态失活电压向超极化方向漂移约10.1mV。结果表明HNTX-Ⅳ是一种新型的蜘蛛毒素,其影响电压门控钠通道的机制可能有别于那些结合于通道位点3来延缓钠电流失活时间特征的蜘蛛毒素如δ-澳洲漏斗网蛛毒素,μ-美洲漏斗网蛛毒素I-Ⅵ等。     

海南捕鸟蛛毒素-IV对大鼠背根神经节细胞钠通道的抑制影响(英文)

海南捕鸟蛛毒素 IV(HNTX IV)是从中国捕鸟蛛Seleconosmiahainana粗毒中分离得到的一种肽类神经毒素 ,在成年大鼠背根神经节 (DRG)细胞上观察了该毒素对电压门控钠通道的影响。在全细胞膜片钳条件下 ,HNTX IV能明显抑制哺乳动物神经性河豚毒敏感型 (TTX S)钠电流 ,但不影响河豚毒不敏感型 (TTX R)钠电流。HNTX IV对DRG细胞TTX S钠电流的抑制作用具有浓度依从性 ,其有效半抑制浓度 (IC50 )为 44 .6nmol/L。该毒素不影响DRG钠电流的激活与失活时间特征 ,但能导致钠通道的半数稳态失活电压向超极化方向漂移约 10 .1mV。结果表明HNTX IV是一种新型的蜘蛛毒素 ,其影响电压门控钠通道的机制可能有别于那些结合于通道位点 3来延缓钠电流失活时间特征的蜘蛛毒素如δ 澳洲漏斗网蛛毒素、μ 美洲漏斗网蛛毒素I VI等。     

虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素-III对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响

HWTX-III是从中国虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena粗毒中分离纯化到的一种昆虫神经多肽。通过应用全细胞膜片钳技术研究了HWTX-III对美洲蜚蠊Periplaneta americana神经细胞电压门控离子通道的影响。发现HWTX-III特异性地抑制美洲蜚蠊背侧不成对中间(dorsal unpaired median, DUM）神经细胞的电压门控钠通道(IC50≈1.106 μmol/L),而对电压门控钾通道没有明显的影响。HWTX-III通过一种新型的不同于其他蜘蛛毒素的机制抑制昆虫电压门控钠通道,它不影响通道的激活与失活动力学,也不明显地漂移稳态失活曲线。HWTX-III对昆虫神经细胞电压门控钠通道的特异性与新型作用机制为研究电压门控钠通道分子结构的多样性以及开发新的安全的杀虫剂提供有用的工具。     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅴ分离纯化及其抑制河豚毒敏感型钠通道活性研究

经阳离子交换和反相HPLC柱层析从海南捕鸟蛛（Seleconosmia hainana）粗毒中分离到1种新的神经毒素,命记为海南捕鸟蛛毒素－Ⅴ（Hainantoxin-Ⅴ,HNTX-Ⅴ）,MALDI－TOF质谱鉴定分子量为3969.5Da。在全细胞记录膜片钳模式下,HNTX－Ⅴ对成年大鼠背根神经节（DRG）细胞河豚毒敏感型（TTX－S）钠电流有抑制作用,但对河豚鼠不敏感型（TTX－R）钠电流无明显影响。HNTX－Ⅴ对TTX－S钠电流的抑制作用具有浓度依从性,其有效半抑制浓度（IC50）为46.8nmol/L。HNTX－Ⅴ不影响TTX－S钠电流的激活相和失活相,对钠通道的激活阈值和最大激活电压也无明显改变,表明HNTX－Ⅴ影响钠通道的作用机制明显有别于δ－ACTXs等蜘蛛毒素,推测HNTX－Ⅴ很可能类似于河豚毒、Saxitoxin和μ－conotoxins,同样作用于钠通道的位点S1。     

Arg26和Lys27突变对海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ生物活性影响

海南捕鸟蛛毒素Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是一种新型的从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化的作用于河豚毒素敏感型(tetrodotoxinsensitive,TTXS)钠通道阻断剂.采用2D1HNMR技术解析HNTXⅣ的空间结构为胱氨酸抑制剂结模体,为进一步阐述HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,应用固相Fmoc方法化学合成了用丙氨酸代替海南捕鸟蛛毒素Ⅳ第26位精氨酸的单残基突变体R26AHNTXⅣ和第27位赖氨酸的单残基突变体K27AHNTXⅣ.合成的突变体用谷胱甘肽法氧化复性并通过反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化.通过MALDITOF质谱测定突变体的分子量.通过核磁共振谱仪测定突变体的空间结构.通过全细胞膜片钳实验比较天然HNTX-Ⅳ(nHNTX-Ⅳ)和两个突变体分子的生物学活性.结果发现,nHNTX-Ⅳ的R26或K27被突变后的空间结构没有发生明显变化.R26AHNTX-Ⅳ能明显抑制TTXS钠电流,K27AHNTX-Ⅳ对TTXS钠电流无明显影响.说明第26位的精氨酸与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关,而第27位赖氨酸则是HNTX-Ⅳ的关键残基.     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ在大肠杆菌中的分泌表达及纯化

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素，并且能够选择性抑制Na_v1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-Ⅳ的成熟肽含有35个氨基酸残基，其结构通过3对二硫键稳定。HNTX-Ⅳ是研究钠通道结构和功能以及镇痛药物开发过程中非常有用的一种分子探针，但是其在天然毒素中的含量较少，很难分离足够量的组分进行后续研究。在本研究中，我们通过OEPR克隆构建了HNTX-Ⅳ的大肠杆菌分泌表达质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ。将质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行自动诱导分泌表达，含有6×His标签和SUMO标签的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ成功分泌到大肠杆菌的细胞外培养基中。通过弱阳离子交换柱富集和Ni-NTA柱纯化之后，成功获得了纯度较高的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ。通过Ulp1激酶切割，重组HNTX-Ⅳ(rHNTX-Ⅳ)被释放出来...     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ的分离纯化及鉴定

从分布于我国海南省的海南捕鸟蛛（Selenocosmia hainana)粗毒中,应用阳离子交换色谱和反相高效液相色谱分离得到1种多肽神经毒素,命名为海南捕鸟蛛毒素－Ⅵ（Hainantoxin-Ⅵ,HNTX-Ⅵ)。MALDI－TOF南谱分析及氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为3.998 49kDa,序列为NH2－ECKYLWGTCEKDE－HCCEHLGCNKKHGWCGWDGTF－COOH,其中的6个Cys形成3对二硫键。HNTX－Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头传递,脑室及硬膜外注射毒能使小鼠瘫软。同源性搜索表明该毒素与蜘蛛Grammostola spatulata毒素HaTx和蜘蛛Scodra griseipes中的SGTx1毒素有很高的同源性,而后两种毒素均为K^ 通道阻断剂。     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HNTX-Ⅰ)的1H-NMR信号归属和二级结构分析

海南捕鸟蛛毒素-Ⅰ(HNTX-Ⅰ)是从海南捕鸟蛛(Ornithoctonus hainana)的粗毒中纯化的一种新型神经毒素.应用二维1H-NMR技术研究HNTX-Ⅰ的溶液结构特点,通过分析水和重水中的DQF-COSY、TOCSY和NOESY谱,识别出HNTX-Ⅰ全部33个氨基酸残基自旋体系;通过NOESY谱中的dαN、dβN、dNN和dαδ联系完成了序列专一的谱峰归属,从而确认了HNTX-Ⅰ所有的主链质子和大于96%的侧链质子的化学位移.并通过分析3JNH-CαH耦合常数、序列间的NOE联系以及慢氢交换质子等,确定HNTX-Ⅰ的二级结构主要是由三股反平行的β-折迭组成(Lys7-Cys9,Tyr20-Asn23和Trp28-Val31),这些结构特点与已经探明结构的其它蜘蛛毒素的基本相同.这些结果为完全解析HNTX-Ⅰ的溶液三维结构奠定了基础.     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ突变体的固相合成和生理活性分析

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)是从我国海南捕鸟蛛粗毒中分离出的一种TTX-敏感型的钠离子通道阻断剂,由35个氨基酸残基组成,含3对二硫键.为了研究HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代HNTX-Ⅳ第12位丝氨酸(Ser12)的突变体S12A-HNTX-Ⅳ和替代第29位精氨酸(Arg29)的突变体R29A-HNTX-Ⅳ.合成的突变体经谷胱甘肽法氧化复性和纯化后,分别用MALDI-TOF质谱进行分子量鉴定,用一维核磁共振波谱法分析空间结构的变化,膜片钳电生理方法分析生物学活性.结果表明,Ser12和Arg29被Ala突变后没有明显影响分子的空间结构,S12A-HNTX-Ⅳ的生物学活性与天然HNTX-Ⅳ的相近,提示Ser12与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关或关系不大;而R29A-HNTX-Ⅳ的生物学活性下降了155倍,说明Arg29是与HNTX-Ⅳ生物学活性相关的关键残基之一.推测R29A-HNTX-Ⅳ活性的降低是由于Ala替代Arg后改变了HNTX-Ⅳ与受体作用的位点,而不是由于毒素分子整体空间结构变化所致.     

虎纹捕鸟蛛毒素XI (HWTX-XI) 突变体的真核表达及活性鉴定

虎纹捕鸟蛛毒素-XI (HWTX-XI) 是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离的含55个氨基酸残基的蛋白质,兼有胰蛋白酶抑制活性和电压门控钾离子通道抑制活性。通过突变HWTX-XI上的钾离子通道抑制活性关键氨基酸残基设计了2个突变体 (分别突变以下氨基酸残基：R5I,R10T,R25A和R5I,R25A),利用pVT102U/α表达载体在酿酒酵母S78中成功表达并获得了高纯度的重组蛋白质;通过分光光度计比色法、膜片钳技术和小鼠脑室注射分别比较三者的胰蛋白酶和钾通道抑制活性以及动物毒性,结果显示：HWTX-XI突变体与     

两种虎纹捕鸟蛛昆虫毒素的分离纯化及生物学活性鉴定

结合离子交换和反相高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛粗毒分离纯化到 2种虎纹捕鸟蛛毒素 ,命名为虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ .经质谱测定这 2种毒素的分子量分别为 3981 0 2和 4 171 12 .氨基酸序列分析发现 ,这 2种虎纹捕鸟蛛毒素同源性非常高 ,只有 6个残基位点的不同 .虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ的生物学功能相似 ,都能对蝗虫起到麻痹作用 ;对小鼠的中枢神经作用高剂量能使小鼠产生致死 ,但低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ能使小鼠产生惊厥反应 ,而低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ不能使小鼠产生惊厥反应 ;这 2种毒素都能阻断小鼠离体膈神经膈肌的神经肌肉传递 ,且与虎纹捕鸟蛛毒素 I混合后都具协同作用     

虎纹捕鸟蛛毒素-III及其天然突变体的纯化与鉴定(英文)

虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离得到的两个毒素多肽。虎纹捕鸟蛛毒素 III含 33个氨基酸残基 ,其中包含 6个半胱氨酸残基 ;而其天然突变体只比虎纹捕鸟蛛毒素 III少了C端的色氨酸残基。MALDI TOF质谱测得虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体的分子量分别为 385 3.35和 36 6 7.4 0。通过比较其理论分子量和质谱测定的分子量表明两个多肽的 6个半胱氨酸残基分别形成了三对二硫键。虎纹捕鸟蛛毒素 III与从同一种蜘蛛分离得到的凝集素 I具有 70 .5 %的序列相似性。生物学活性实验表明 ,虎纹捕鸟蛛毒素 III具有使美洲蜚蠊可逆的致瘫作用 ,其半有效剂量 (ED50 )为 (1 92 .95±1 2 0 .84 ) μg/g (P =0 .95 ) ,而且能加强由电刺激引起的大鼠输精管收缩 ;而其天然突变体却不具有上述生物学活性 ,表明C端色氨酸残基为虎纹捕鸟蛛毒素 III生物学活性相关残基 ;同时虎纹捕鸟蛛毒素 III及其天然突变体都不具有类似于凝集素 I对红细胞的凝集活性 ,表明虎纹捕鸟蛛毒素 III和凝集素 I两者氨基酸序列中不同氨基酸残基对于决定两者的生物学活性有着重要的作用     

三种蜘蛛粗毒对NG108—15细胞电压门控钠通道的抑制作用

利用小鼠神经细胞瘤×大鼠神经胶质细胞的杂交细胞NG108-15,通过全细胞记录(whole-cellrecording)模式的膜片钳技术,检验了虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)、海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)和广西大疣蛛(Macrothele guangxiasp)的粗毒对NG108-15细胞膜上电压门控TTX敏感型钠电流和延迟整流钾电流的作用.结果表明,三种蜘蛛粗毒对外向延迟整流钾电流没有明显作用,但对TTX敏感型的快钠电流表现出较强的抑制效应.抑制效应呈量效关系.三种粗毒抑制钠电流的EC     

虎纹捕鸟蛛毒素-X的1H-NMR信号归属

虎纹捕鸟蛛毒素-X(huwentoxin-X,HWTX-X)是从虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)的粗毒中纯化的一种新型N-型电压敏感钙离子通道抑制剂.应用二维1H-NMR技术研究HWTX-X的溶液结构特点,通过分析水和重水中的DQF-COSY、TOCSY和NOESY谱,识别出全部28个氨基酸残基自旋体系;利用NOESY谱中的dαN、dβN、dNN和dαδ联系完成了序列专一的谱峰归属,从而确认了HWTX-X所有的主链质子和大于95%的侧链质子的化学位移,为完全解析HWTX-X的溶液三维结构奠定了基础.     

Lys4突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响

敬钊缨毛蛛毒素-V(jingzhauotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第4位赖氨酸残基的突变体K4A-JZTX-V,合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物分别用MALDI-TOF/TOF质谱进行相时分子质量的鉴定,用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析.研究结果表明,Lys4被Ala取代后,K4A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V基本相当,提示Lys4与JZTX-V时TTX-S钠通道的抑制活性关系不大;而K4A-JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约8.3倍,说明Lye4是JZTX-V与河豚毒素不敏感型钠通道抑制活性相关的氨基酸残基.     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅵ的分离纯化与鉴定

通过离子交换及反相HPLC,从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到1种新的哺乳类神经毒素,命名为虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅵ（Huwentoxin-Ⅵ,HWTX-Ⅵ）。MALDI-TOF质谱仪分析及氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为4.44018kDa,序列为H2N-CIGEG VPCDE NDPRC CSGLV VLKKT LHGIW IKSSY CYKCK-COOH,其中6个Cys形成3对二硫键,小鼠脑内注射实验表明,HWTX-Ⅵ对神经系统具有明显的致瘫作用。这种致瘫作用又具有可逆性。     

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的二硫键定位分析

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ是从虎纹捕鸟蛛毒液中分离得到的一种昆虫毒素.它含有35个氨基酸残基,其中6个半胱氨酸形成三对二硫键.首先采用多酶将天然的肽链裂解后,通过MALDI-TOF质谱分析酶解肽段,推断出1对二硫键位于Cys9-Cys21,然后利用改进的部分还原分步测序法,确定虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的另外2对二硫键的配对方式为Cys2-Cys16和Cys15-Cys28.因此,虎纹捕鸟蛛毒素Ⅴ的3对二硫键分别以Cys2-Cys16,Cys9-Cys21,Cys15-Cys28（即1-4、2-5和3-6）的方式配对.     

《生命科学研究》2014年封面插图说明

<正>2014年《生命科学研究》封面左上角的插图是海南捕鸟蛛毒素-III(Hainantoxin-III,HNTX-III)的生物活性表面模型图。HNTX-III是由湖南师范大学蛋白质与发育生物学教育部重点实验室从海南捕鸟蛛毒液中分离纯化到的一个新型河豚毒素敏感型钠通道抑制剂,由33个氨基酸残基组成,含有三对二硫     

Arg20突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响

敬钊缨毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-V, JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂, 为了深入研究该毒素的结构与功能关系, 应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第20位精氨酸残基的突变体R20A-JZTX-V, 合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性。复性产物分别用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)进行分子量的鉴定, 用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析。研究结果表明, Arg20被Ala取代后, R20A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞(DRG)膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V相当, 提示Arg20与JZTX-V对TTX-S钠通道的抑制活性无关或关系不大; 而R20A-JZTX-V对TTX-R钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约18.3倍, 说明Arg20是与JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道抑制活性相关的关键活性残基之一, 推测R20A-JZTX-V活性降低的原因是用Ala替代Arg20后改变了JZTX-V与TTX-R型钠通道的作用位点。