大香格里拉土壤放线菌组成分析及生物活性测定

【目的】探究大香格里拉地区的土壤放线菌组成及其抑菌和酶活性,为放线菌新药物先导化合物和高活性酶的筛选提供资源。【方法】从大香格里拉地区不同海拔高度采集220份土样,用4种培养基,分别进行了常温放线菌和低温放线菌的分离。从常温放线菌中选择25株代表菌株进行了初步分类鉴定。采用琼脂扩散法,检测了其对4株细菌和7株农作物致病真菌的抑菌活性;利用特异性引物扩增法,筛选了其聚酮合酶(PKSⅠ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因。同时,检测了低温菌的多种酶活性。【结果】25株常温代表菌的系统发育分析显示它们分属于放线菌目的6个亚目、12个科、15个属。其中14株菌的NRPS及11株的CYP基因筛选呈阳性。低温条件下分离到的111株放线菌,88%属于耐冷菌,12%是嗜冷菌,它们中的大部分能利用明胶、纤维素,甲壳素等。【结论】研究结果显示,大香格里拉森林土壤蕴涵着种类和活性丰富的放线菌,为放线菌资源的开发利用和保护提供了新依据。     

川楝内生放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】探究药用植物川楝内生放线菌多样性,从中挖掘出新的放线菌菌株,发现新的潜在农业生防和医药先导化合物。【方法】从四川境内的资阳、遂宁以及重庆万州采集川楝的根、茎、叶、果、皮,采用纯培养方法,用4种培养基共分离获得148株放线菌。通过形态学观察筛选出60株放线菌进行RFLP分析,选出代表菌株进行16S r RNA基因序列分析。以3株细菌和6株病原真菌作为指示菌株,检测初筛出的60株菌株的抗菌活性以及聚酮合酶(PKSⅠ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和卤化酶(Halo)基因。【结果】基于16S r RNA-RFLP分析,60株放线菌被分成10簇,筛选出25株代表菌株分别属于7个属,包括Streptomyces、Micromonospora、Planotetraspora、Streptosporangium、Nocardiopsis、Prauseria、Microbispora,其中链霉菌占73.3%。供试的川楝内生放线菌对细菌、真菌有不同程度的抗菌活性;其中含有4类化合物合成基因的菌株占10%-55%。【结论】药用植物川楝内生放线菌具有丰富的多样性,且不同地区不同部位川楝组织中放线菌的种群存在差异;分离菌株广谱的抗菌活性证明,川楝内生放线菌在次生代谢产物合成方面具有巨大潜力,这为进一步的药物开发提供了丰富的菌种资源。     

武陵山放线菌多样性

[目的]为了探究武陵山放线菌多样性,以便从新放线菌菌株中发现新的潜在药物先导化合物.[方法]从武陵山采集280份土样,采用纯培养的方法,用4种培养基分离到1134株放线菌.选择其中30株代表菌进行了初步分类鉴定;以3株细菌和7株农作物致病真菌作为指示菌,检测其抑菌活性;利用特异性引物扩增的方法,检测是否具有聚酮合酶(PKS Ⅰ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因.[结果]分离到的武陵山放线菌中,链霉菌占70%以上,还有小单孢菌等8个科13个属,其中有5个菌株是潜在的新种.选取的30株实验菌对细菌、真菌有不同程度的抗菌活性;其中含有4类化合物合成基因的菌株占23%～60%.[结论]武陵山原始森林土壤中,放线菌多样性很丰富,且存在很多未开发的稀有类群.有抑菌活性的菌株,可用于进一步的药物开发利用.     

肇庆星湖湿地可培养放线菌多样性

摘要:【目的】探究星湖湿地可培养放线菌物种多样性,筛选潜在药源活性代谢产物产生菌,为后续菌种资源开发奠定基础。【方法】采用5种选择性分离培养基分离星湖湿地底泥中的放线菌,通过16S rRNA基因同源性分析代表性菌株的物种多样性;以3株病原细菌为指示菌检测分离菌株的抑菌活性;PCR扩增代表菌株的聚酮合酶(PKS I、PKS II)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因、安莎类化合物(AHBA)基因及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGA)基因。【结果】分离到135株放线菌菌株,被鉴定为放线菌纲的7 个目、10个科、13个属,优势类群为链霉菌、小单孢菌及诺卡氏菌。83株检测菌中,24.09%抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),4.8%抗大肠杆菌(Escherichia coli);24株高活性菌株中PKS I阳性率16.7%,PKS II阳性率62.5%,NRPS阳性率16.7%,AHBA阳性率12.5%,HMGA阳性率29.2%。活性复筛及HPLC结果显示,菌株XD007、XD114和XD128显著抑制3株病原指示菌,且能产生大量次级代谢产物。【结论】星湖湿地底泥中放线菌资源丰富,筛选到的活性菌株可用于后续药源活性次级代谢产物的分离。     

河北九莲城淖尔可培养放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】勘探干涸的九莲城淖尔土壤放线菌多样性并进行活性筛选,以期发现药用微生物资源,为新抗生素的发现奠定基础。【方法】采用15种分离培养基,以稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S rRNA基因序列同源性分析放线菌多样性;发酵液经乙酸乙酯萃取,菌丝体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品;样品通过纸片扩散法进行抗菌活性初筛;抗菌阳性菌株采用PCR技术进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS I)KS域、Ⅱ型聚酮合酶(PKS II)KS域和非核糖体多肽合成酶(NRPS)A结构域抗生素生物合成基因的检测。【结果】从11份盐湖土壤样品中分离纯化到251株放线菌,其分布于放线菌纲的10个目15个科31个属,其中优势菌属为链霉菌属和拟诺卡氏菌属;251株放线菌中包括57株耐(嗜)盐放线菌,其优势菌属为拟诺卡氏菌属(22株)和涅斯捷连科氏菌属(15株)。基于16S r RNA基因序列的系统发育分析显示,菌株J11Y309为糖霉菌科潜在新属,菌株J12GA03为分枝杆菌科潜在新种。96株放线菌活性检测结果显示,56株至少对1株检定菌具有抗菌活性,阳性率为58.3%;56株有活性的放线菌中,47株至少含有1种抗生素生物合成基因,其中17株同时具有3种抗生素生物合成基因。【结论】干涸的九莲城淖尔土壤中含有较为丰富的药用放线菌资源,具有从中发现放线菌新物种和新抗生素的潜力。     

胶州湾沉积物可培养细菌的多样性及其抑菌活性

【目的】海洋微生物在活性物质开发方面具有巨大的应用前景。为了研究胶州湾微生物的多样性和抑菌活性,选取胶州湾9个观测站点的沉积物进行了细菌多样性及抑菌活性分析。【方法】采用YPD和Z2216E培养基分离细菌,通过16S r RNA基因测序对分离菌株进行分类鉴定,继而采用牛津杯法考察分离菌株对7株指示菌的抑菌活性,最后用PCR方法筛选16株代表菌的PKSI、NRPS、CYP、Phz E和d TGD基因。【结果】从胶州湾沉积物中共分离出76株细菌,通过对16S r RNA序列分析,将其归为8个科11个属:节杆菌属、考克氏菌属、微球菌属、微杆菌属、假交替单胞菌属、Oceanisphaera、海单胞菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属,其中分离细菌中有34株至少对1种指示菌有抑菌活性。所选取的16株菌均能检测到一种功能基因,且其中5株菌能同时检测到3种以上的功能基因。【结论】以上研究表明胶州湾海域有丰富的微生物资源,在生物活性次级代谢产物合成上有较大潜力。     

芍药内生真菌的鉴定及产生活性次生代谢产物的评估

【目的】研究药用植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)内生真菌的种群多样性,同时对其可能存在的聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)和非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因多样性进行评估,预测芍药内生真菌产生活性次生代谢产物的潜力。【方法】采用组织分离法获得芍药根部内生真菌菌株,结合形态学特征和ITS序列分析,进行鉴定;利用兼并性引物对内生真菌中存在的聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列测定分析,构建系统发育树,明确芍药内真菌PKS基因序列和NRPS基因序列的系统进化地位。【结果】从芍药组织块中共分离得到105株内生分离物,去重复后获得52株内生真菌,菌株ITS基因序列信息显示,52株芍药内生真菌隶属于7目、13科、15属,其中小球腔菌属(Leptosphaeria)、土赤壳属(Ilyonectria)和镰孢属(Fusarium)为优势种群;从52株内生真菌中筛选获得13株含PKS基因片段的菌株,8株含NRPS基因片段的菌株,部分菌株功能基因的氨基酸序列与Gen Bank中已知化合物的合成序列具有一定的同源性,预示芍药根部内生真菌具有合成丰富多样的次生代谢产物的潜力。【结论】药用植物芍药根部具有丰富的内生真菌资源,且具有产生活性次生代谢产物的潜力,值得进一步开发研究和应用。     

波罗的海放线菌的多样性

摘要:【目的】为了探索海洋放线菌的多样性,为发现新的药物先导化合物提供新菌源,我们分析了波罗的海的放线菌多样性及生物活性。【方法】采集100 份底泥样品,用7 种培养基分离放线菌809 株;去掉相同菌株后,选择280 株代表菌进行了初步分类鉴定;采用琼脂扩散法,检测了它们对5 种细菌、真菌的抗菌活性;用API ZYM system 测定了21 种酶的活性。【结果】用海藻糖-脯氨酸培养基和HV 培养基分离的放线菌中,稀有放线菌占60% 和63% ;波罗的海的放线菌有15 个属,其中3 个属是首次从海洋中分离     

分离自黑茶的散囊菌属真菌中的NRPS基因的检测和分布

【目的】检测源自黑茶的散囊菌属分离菌株中的NRPS基因,推测它们相应的次级代谢产物合成能力,并考察了基于NRPS基因分布特征进行散囊菌属真菌遗传多样性分析的可能性。【方法】运用IQS法提取来自湖南、四川和湖北等地黑茶样品的14株散囊菌(Eurotium spp.)菌株的总DNA,利用特异性引物对菌株中11种NRPS基因片段进行PCR检测和序列分析,并结合UPGMA法分析了NRPS基因的分布。【结果】各菌株分别含有4 10个NRPS基因片段。NRPS7、CPS1基因在所有菌株中都可以检测到,而NRPS2、NRPS6基因则仅在个别菌株中检测到;其它NRPS基因的分布则呈现出多样性。来自同一块砖茶的菌株Fw-30813-7、Fw-30813-4、Fw-30813-1和Fw-30925-5之间,NRPS1、NRPS2、NRPS3、NRPS4和NRPS8五个基因的分布存在差异,显示出黑茶内散囊菌的遗传多样性。来自湖南白沙溪茶厂的茯砖样品的菌株Fa-20719-3不含有NRPS5和NRPS8基因;而从湖南益阳茶厂茯砖茶7个分离菌株中均含有这两种基因。不同地点加工出来的黑茶样品中的散囊菌菌株之间存在一些明显的遗传差异。【结论】首次从我国黑茶中的散囊菌属分离菌株中检测到NRPS基因,并推测了NRPS产物的多样性,展示了其多样化分布特征,提示NRPS基因的分析有可能成为衡量散囊菌遗传多样性的另一个尺度。     

察汗淖放线菌资源探查及抗菌活性筛选

【背景】细菌耐药形势严峻,寻找新型抗生素迫在眉睫。放线菌是生产抗生素的重要药物资源。盐湖是一种高盐度的内陆水体,既往研究表明其中的放线菌物种多样、新资源丰富、生物活性广泛,极具开发潜力。【目的】探究察汗淖盐湖土壤中放线菌菌种的组成,并筛选抗菌活性菌株,为发现新颖的抗菌化合物储备菌种资源。【方法】采用19种选择培养基,以涂布平板法分离放线菌。基于16S r RNA基因的相似度鉴定菌株,并分析其多样性和新颖性。根据菌属类别及其新颖性,选择代表菌株进行Ⅰ型、Ⅱ型聚酮合酶(polyketide synthases,PKS)和非核糖体肽合成酶(non-ribosomal polypeptide synthases,NRPS)抗生素生物合成基因的PCR扩增;代表菌株的发酵液上清和菌体分别经乙酸乙酯和丙酮提取后,采用纸片扩散法进行抗菌活性检测。【结果】从9个土壤样品中分离获得250株放线菌,隶属于放线菌纲的9个目16个科28个属,链霉菌属(88株,占比35.2%)和拟诺卡氏菌属(68株,占比27.2%)为优势菌属。15株链霉菌与近缘菌株16S r RNA基因的最高相似度低于98.65%,推测其归属于...     

西双版纳、白茫雪山、波罗的海南岸地衣纯培养放线菌多样性

【背景】在地衣共生系统中除了共生真菌、藻类以外,还蕴藏着丰富的放线菌资源。【目的】采集来自云南西双版纳、白茫雪山、德国波罗的海南岸3个地区的地衣,对获得的地衣纯培养放线菌进行多样性分析。【方法】采用3种放线菌选择分离培养基,通过平板稀释涂布法分离放线菌。通过比较16S rRNA基因序列相似性以及构建系统发育树,确定纯培养放线菌的分类地位。【结果】共分离菌株1 123株,鉴定417株。其中从西双版纳17份地衣样品中分离纯化到107株放线菌,分布在7个目14个科33个属,潜在新种18株,其中链霉菌为优势菌属;从白茫雪山7份地衣样品中分离纯化到103株放线菌,分布在4个目5个科9个属,潜在新种16株。其中链霉菌为优势菌属,占比39%;从波罗的海南岸5份地衣样品中分离纯化到65株放线菌,分布在4个目8个科18个属,潜在新种5株,潜在新种菌和链霉菌为优势菌属。【结论】在本研究条件下,西双版纳可培养地衣放线菌多样性较白茫雪山和波罗的海南岸丰富。白茫雪山地衣链霉菌居多,潜在新种占比15.5%。3个地区地衣放线菌的区系组成各不相同,这与3个地区地衣所处地理环境、完全不同的气候密切相关。     

来自西双版纳3种有毒植物的免培养与纯培养放线菌多样性及生物活性

【背景】由于土壤放线菌中获得新化合物日益困难,抗生素滥用使致病菌耐药性不断增加,人们转向研究植物内生放线菌以期发现新化合物。【目的】探究西双版纳热带雨林有毒植物内生放线菌的多样性,为开发新药提供具有潜在生物活性的菌株。【方法】通过Illumina Hi Seq高通量测序和纯培养方法分析箭毒木、八角枫、马缨丹3种有毒植物的内生放线菌群落结构组成,利用纸片扩散法筛选抑菌活性,通过PCR扩增检测7类化合物合成基因。【结果】高通量测序的多样性分析和群落结构分析得出:3种有毒植物在门分类水平检测出古菌域的2个门、细菌域的18个门和暂定的Rsa HF231、WD272门;在属分类水平检测出30个属的放线菌,八角枫和马缨丹的微生物群落结构比箭毒木更丰富。纯培养分离获得11个属34株菌,分离自箭毒木的菌株比八角枫和马缨丹的菌株更多,而且大多数高通量检测出的菌种不能通过纯培养获得。抑菌活性检测结果显示:抗菌活性作用明显的菌株以链霉菌属为主。链霉菌属的NRPS和PKS基因的检出率明显高于其他化合物合成基因。【结论】有毒植物内生放线菌多样性非常丰富。有毒植物内生放线菌具有合成次生代谢产物的潜力,可以为生物农药及抗生素开发提供丰富的菌种资源。     

小蓬竹根际土壤微生物及内生真菌多样性分析

为了解喀斯特典型物种-小蓬竹根际土壤微生物及不同部位内生真菌多样性,采用沿等高线等距离取样法采集小蓬竹根际土壤及健康植株,通过可培养对根际土微生物及内生菌进行分离,利用分子技术对其进行鉴定,根据鉴定结果构建系统发育树,并计算小蓬竹根际土壤微生物和根茎叶内生真菌多样性。结果如下：（1）共从根际土壤、根、茎、叶分离得到139个真菌菌株,隶属于27属,其中根际土壤分离得到34个真菌菌株隶属于12属,根部分离得到的63个内生真菌菌株隶属于17个属,茎部分离得到的14个内生真菌菌株隶属于8个属,叶部分离得到28个内生真菌菌株隶属于9个属;（2）根际土壤共分离得到41株细菌菌株,隶属于7个属26个种,20株放线菌菌株,隶属于1属15种;从Shannon-Wiener多样性指数、均匀度指数、Simpson指数排序来看,真菌主要表现为根 > 根际土壤 > 茎 > 叶,细菌和放线菌多样性均较低。（3）按层次聚类分析可分别将真菌、细菌、放线菌聚为3支。小蓬竹根际土壤、根、茎和叶具有丰富的微生物多样性,不同部位菌群组成存在差异性（P<0.05）,且存在以假单胞菌属、芽孢杆菌属等为优势属的抗盐耐旱菌群,这有助于揭示小蓬竹对喀斯特生境的适应性,以及为微生物-植物群落之间相互关系提供一定基础数据,为后期寻找小蓬竹相关耐性功能菌奠定基础。     

药用植物内生放线菌的分离、筛选及活性菌株YIM 61470鉴定

从云南西双版纳热带雨林多种药用植物中分离到272株内生放线菌,活性筛选表明 146株菌的发酵产物具有抗菌活性,其中94株菌具有拮抗病原细菌活性,127株菌具有抑制病原真菌的功能.分离菌株YIM 61470具有广谱抗菌活性,通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的相似性分析等研究,菌株YIM 61470被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)氢化链霉菌(S.llydrogenans)的一个菌株.     

百部内生放线菌的分离、分类及次级代谢潜力

【目的】以对叶百部块根为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成基因研究。【方法】样品经过严格的表面消毒,选用4种培养基分离百部内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S rRNA序列分析进行分类鉴定;采用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS/NPRS和卤化酶基因;使用HPLC-UV/VIS-ESI-MS/MS分析发酵产物。【结果】从6个样品中获得18株内生放线菌,分属链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和甲基杆菌属(Methylobacterium)。分离菌株绝大部分具有抗菌活性和次级代谢产物合成基因,其中13株对耐药金黄色葡萄球菌和/或绿脓杆菌有拮抗活性,17株具有PKS/NRPS基因,8株菌具有卤化酶基因,且卤化酶阳性代表菌株的发酵产物具有抗细菌活性和卤代化合物特征。【结论】百部作为一种传统中药,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,在次级代谢产物合成方面具有很好的潜力,可作为一类重要微生物资源进行活性产物开发。     

灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价

从云南西双版纳采集7份灯台树样品,经过表面消毒,用4种分离培养基分离得到105株内生放线菌。经16S rRNA基因序列分析鉴定,分布于7个科9个属。利用5种植物病原真菌指示菌对所有菌株的发酵液进行抗菌活性检测。结果显示,有12.4%、14.3%、11.4%、12.4%、8.6%的菌株分别对镰刀霉、疫霉、赤星霉、苹果炭疽、白色念珠菌有抗性。对3株具有广谱抗菌活性的菌株进行再次发酵和抗菌活性复筛,结果显示这3株的抗菌活性稳定,并可能含有生物碱类化合物。     

山东半岛农药污染点源放线菌多样性及抑菌活性

【目的】探究山东半岛农药污染点源放线菌多样性及非链霉菌抑菌活性,试图发现新放线菌和新抗生素。【方法】通过16S rDNA序列对已分离得到的154株纯培养放线菌进行初步分类鉴定并进行系统发育分析;采用管碟法和菌丝生长速率法检测10株非链霉菌的抑菌活性。【结果】154株放线菌覆盖7个科,8个属,有一株非链霉菌(205)可能为潜在的新种。10株非链霉菌的发酵液均对供试的植物病原真菌和细菌有不同程度的抑制作用,尤其是菌株Microbacterium oxydans JN853773和Kocuria rosea JN192402对所有供试病原菌都有强烈的抑制作用。【结论】农药污染点源可以作为开发新型抗生素产生菌的重要来源。     

东乡野生稻内生放线菌分离及菌株S123次级代谢产物分析

【目的】从东乡野生稻(Oryza rufipogon)中分离和鉴定内生放线菌,对其进行抗菌活性筛选,并分析高抗菌活性菌株S123的次级代谢产物。【方法】采用S培养基对东乡野生稻内生放线菌进行分离、纯化,并构建16S rRNA基因序列系统发育进化树进行菌株鉴定。以琼脂扩散法和菌丝生长速率法进行抗菌活性筛选,同时设计简并引物检测菌株I型聚酮合酶(PKS-I)基因。对具广谱抗菌活性的菌株S123进行分批大量发酵,运用多种色谱方法对发酵产物进行分离、纯化,利用MS和NMR分析鉴定化合物的结构。【结果】从东乡野生稻中共分离到11株内生放线菌,分别属于链霉菌属(8株)和假诺卡氏属(3株)。其中有8株具有抗菌活性,8株呈现I型PKS阳性。从高抑菌活性菌株S123中分离到化合物Nigericin和17-O-demethylgeldanamycin,其中Nigericin对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及水稻纹枯病菌均有抑制活性。【结论】对东乡野生稻内生放线菌进行了分离、鉴定和抗菌活性筛选,并从中分到两种与I型PKS基因相关活性的化合物Nigericin和17-O-demethylgeldanamycin,为研究东乡野生稻内生放线菌的多样性和次级代谢产物的分离提供依据。     

库拉索芦荟内生真菌菌群的多样性研究

【目的】了解不同生境下库拉索芦荟内生真菌的菌群组成及其动态变化规律。【方法】分别于春、秋两季对云南、四川、广东以及陕西四地的多年生库拉索芦荟采样,进行内生真菌的分离、鉴定及多样性分析。【结果】所得1 442株内生真菌可归于29个属,其中未发现有性世代及不产孢的占96.88%,子囊菌占0.83%,担子菌占0.07%,接合菌占2.22%。内生菌群以链格孢属Alternaria(35.63%)、镰刀菌属Fusarium(12.69%)及拟茎点霉属Phomopsis(11.65%)为优势种群。【结论】云南与四川的样本菌群组成相似性最高(Cs=0.88),广东与云南的差异性最大(Cs=0.73)。在根部,以链格孢属Alternaria、镰刀菌属Fusarium及丝核菌Rhizoctonia属为优势种群;叶中则以链格孢属Alternaria、拟茎点霉属Phomopsis及茎点霉属Phoma为优势种群。此外,不同季节间内生真菌的组成也存在一定差异,春季以丝孢纲类居多(IF=31.42%),秋季则以腔孢纲类居多(IF=31.01%)。