肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性研究

带有基因LacZ的5型缺陷性腺病毒感染肿瘤细胞,X－gal染色,检测腺病毒对肿瘤细胞的转染率。结果显示,随着病毒感染复数量（multiplicityofinfection,m.o．i）的增加,转染率也增高,且无细胞毒作用。各种肿瘤达到100％转染所需病毒量是不同的,人类肿瘤细胞系100％转染所需的m.o．i分别是：Hela细胞为100,GRC肾癌细胞为200,Hep-2喉癌细胞为200,鼠肿瘤所需病毒量较大,Lewis肺癌细胞为500,BST膀胱癌细胞为600。说明不同肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性是不同的。     

谷胱甘肽－硫转移酶在肺癌细胞耐药中的作用

将反义ＧＳＴ－πＲＮＡ通过逆转录病毒载体介导的基因转移技术,导入人肺腺癌阿霉素耐受株细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆出抗性克隆,测定ＧＳＴ总酶活性,对活性最低的一株克隆,进行阿霉素药敏分析和ＧＳＴ－π基因表达的原位杂交分析．结果发现,ＧＳＴ－π基因表达受到明显抑制,总酶活性也大大降低,对阿霉素的抗药性下降了２０％．     

腺病毒载体介导p53基因转移抑制人胃腺癌细胞增殖

采用携带P53基因的腺病毒载体系统Ad－P53进行胃癌的体外实验性治疗,以通过腺病毒感染胃癌细胞后P53基因在癌细胞中高效表达,来抑制胃癌细胞增殖,从而为胃癌术后复发的治疗找到、条有效的途径。用Ad－p53基因综染人胃癌S3C－7901细胞后,进行X－gal染色测定腺病毒转染效率;用P53特异引物扩增转染后的7901细胞外源性P53基因;IX：IZ法用一对引物对Ad－P53转染细胞进行EI区基因检测。结果表明,七MOI大于25时腺病毒转染效率即可达100％。腺病毒EI区基因检测：Ad－P53、Ad－IncXi和PBS感染组均未见阳性扩增带。与Ad一beZ和PB…     

PPFP基因促进人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1增殖和迁徙运动能力的体外实验研究

目的:研究PPFP基因对人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1生物学特性的影响,以明确PPFP是否具有致瘤作用。方法以我们前期实验构建的PPFP基因慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1PPFP、空白慢病毒载体稳定转染细胞株Nthy-ori 3-1Vector和未转染细胞株Nthy-ori 3-1为研究对象,以MTT法检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验检测克隆形成数,软琼脂集落形成实验检测集落形成率,划痕愈合实验观察各组细胞体外迁徙运动能力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期。结果以Nthy-ori 3-1Vector组和Nthy-ori 3-1组细胞为对照组,Nthy-ori 3-1PPFP组细胞较对照组在细胞增殖能力、平板克隆形成数、软琼脂集落形成率、体外迁徙运动能力均明显提高或增强,而细胞凋亡率明显下降,G0/G1期细胞明显减少,S期及G2/M期细胞则显著增加。结论PPFP基因可显著促进人正常甲状腺细胞Nthyori 3-1的增殖能力,并显著抑制其凋亡和促进其迁徙运动能力,提示该基因可能在滤泡状甲状腺癌恶性增殖和侵袭转移过程中起关键性作用。     

pINC—lacZ逆转录病毒载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

小鼠胚胎干细胞系（ES）是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ES细胞系目前正广泛用于将基因打靶后后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ES细胞进行标记。大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－gal）基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期（SiCMVIE）启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ES细胞方面的报道尚未见到。本研究用BamHI和HindIII双酶切,从psv-β-galactosidasec中得到3．7Kb的lacZ基因片断,将其插入妻pINC载体上（Fig.1) ,得到pINC－lacZ(Fig.2)。用NotI线性化pINC－lacZ后,电击导入MESPU－13细胞中。MESPU－13为本实验室从129／Tcr品系小鼠的囊胚中建立的一个ES细胞系。转化细胞在含有250μg/mlG418的培养基上培养两周,进行MESPU－13细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,佾1×10^7个转化的MESPU－13细胞中获得了4个G418抗性克隆。X－gal染色表明：其中3个克隆中有导入的基因表达。由于其中的一个细胞系MC15表现阳性染色（Fig.3)和很好的生长状态,对该系进行了进一步的研究。MC15细胞的二倍体核型正常率为72．4％。MESPU－13细胞不表现β－gal活性;另外,以lacZ基因为探针,对经过BamHI酶切过的MC15细胞基因组DNA进行的Southern分析显示：MC15细胞克隆中仅有一条要交带（Fig.4)。说明该细胞克隆中含有一个单考贝整合。在谱系分析中成功的细胞标记依赖于标记基因的稳定表达。许多强的启动子被用于基因表达的研究。例如鸡的β－肌动蛋白启动子。外源基因可以稳定地整合到未分化细胞的染色体上,然而它们的表达常常被抑制直到随后的分化过程中。本研究中我们首次用强的SiCMVIE启动子构建了pINC－lac载体,由SiCMVIE启动子引导转录的lacZ基因能够在ES细胞中表达。然而lacZ的表达仅存在于3个克隆中,另一个克隆并不表现β－gal活性。很可能在不同整合位为上基因的表达是不同的。     

Adiponectin 基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.     

穿膜素TAT介导的KDR-siRNA慢病毒载体的构建及其靶向肺癌A549细胞的抗肿瘤作用

为了构建TAT与KDR-siRNA慢病毒载体,观察其对肺癌细胞株 A549的体外靶向抗肿瘤作用,利用重组技术构建TAT-KDR siRNA慢病毒载体并转染人肺癌细胞株 A549。实时荧光定量PCR、Western blot检测KDR基因水平变化;流式细胞仪、MTT 法、集落形成试验检测其对A549细胞株细胞凋亡、细胞增殖和克隆形成的影响;细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。其抗癌作用主要表现为可有效地抑制A549细胞KDR基因表达、细胞增殖和克隆形成,促进细胞凋亡,并具有肿瘤靶向性作用。因而认为,TAT与KDR靶向siRNA慢病毒载体具有显著的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性。     

c－erbB2／neu扩增诱导人前列腺癌细胞的转移能力

用突变的ｃ－ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌基因转染人类ＰＣ３细胞系,使转化克隆Ｎ３５具有癌转移能力,在接种到裸鼠后能向肺、骨髓等远处转移．各项实验指标证实,外源性的ｎｅｕ基因已整合至人类细胞的染色质ＤＮＡ中,并获得基因扩增和高表达．结果提示ｎｅｕ癌基因与肿瘤的发展和转移能力的形成有密切的关系．     

重组腺病毒介导IL-2、TNF-α抗肿瘤实验研究

目的　研究腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a对人肺腺癌细胞系的生物学特性的影响 ,探讨重组腺病毒的体内抗肿瘤作用。方法　将分别携带有hIL 2基因、hTNF a基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2、rAd hTNF a)感染人肺腺癌Anip973细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2、TNF a的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2、rAd hTNF a的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果　rAd hIL 2、rAd hTNF a经纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒为 30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。体外转染的肿瘤细胞生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4h细胞培养上清IL 2的分泌量为 5 0pg 2× 10 5细胞 ,TNF a的分泌量为 2 0pg 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd LacZ、rAd hIL 2、rAd hTNF a的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论　腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2、hTNF a转染的肿瘤细胞形态学未见明显变化。转染hIL 2、hTNF a基因的肿瘤细胞可表达IL 2及TNF a。rAd hIL 2、rAd hTNF a重组腺病毒具有抗肿瘤作用     

沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.     

表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的gal B16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制gal B16肿瘤生长的作用。     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定

目的:检测白蛋白启动子介导的Cre重组酶转基因小鼠Alb-Cre-2中Cre重组酶的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法:将Alb-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配,利用PCR对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测;然后,将Alb-Cre-2转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。结果:PCR结果显示心、肺、胰、脑及消化道中Cre重组酶介导的Smad4基因发生重组;LacZ染色进一步表明Cre重组酶在肝细胞、胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞、大肠柱状细胞及空泡细胞中特异性表达,并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。结论:Alb-Cre-2转基因小鼠在消化道中具有一定的组织特异性,只在胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞,大肠柱状细胞及空泡细胞等细胞类型中特异性表达,并能在体内成功地介导这些消化道上皮细胞基因组上LoxP位点间的重组,是一种研制在消化道特定细胞中特异性基因剔除小鼠的良好工具小鼠。     

EGFP-LacZ双报告基因真核表达载体的构建及体外表达

构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ 中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定后,在脂质体介导下转染293FT细胞株及鸡胚成纤维细胞,通过荧光观察和组织化学方法检测Egfp和LacZ基因的表达。结果表明,LacZ基因被克隆到pEGFP-C1,成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光,组织化学方法检测到呈蓝色的细胞,表明两个报告基因均能在细胞内正确表达。     

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research¹, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials². Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging^3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR⁵, FACS⁶ or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme β-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye⁷ and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis⁸ in studies assessing new anticancer therapies^9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.¹² who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model¹³, which was originally described to be non-metastatic¹⁴.     

Generation of stable cell line by using chitosan as gene delivery system

Establishing stable cell lines are useful tools to study the function of various genes and silence or induce the expression of a gene of interest. Nonviral gene transfer is generally preferred to generate stable cell lines in the manufacturing of recombinant proteins. In this study, we aimed to establish stable recombinant HEK-293 cell lines by transfection of chitosan complexes preparing with pDNA which contain LacZ and GFP genes. Chitosan which is a cationic polymer was used as gene delivery system. Stable HEK-293 cell lines were established by transfection of cells with complexes which were prepared with chitosan and pVitro-2 plasmid vector that contains neomycin drug resistance gene, beta gal and GFP genes. The transfection efficiency was shown with GFP expression in the cells using fluorescence microscopy. Beta gal protein expression in stable cells was examined by beta-galactosidase assay as enzymatically and X-gal staining method as histochemically. Full complexation was shown in the above of 1/1 ratio in the chitosan/pDNA complexes. The highest beta-galactosidase activity was obtained with transfection of chitosan complexes. Beta gal gene expression was 15.17 ng/ml in the stable cells generated by chitosan complexes. In addition, intensive blue color was observed depending on beta gal protein expression in the stable cell line with X-gal staining. We established a stable HEK-293 cell line that can be used for recombinant protein production or gene expression studies by transfecting the gene of interest.