肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39 237.86 min-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L,氢醌的转化率接近99%。综上所述,文中克隆并研究了重组SPase,并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。     

重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷

利用重组大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-SPase发酵生产蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液,通过镍NTA亲和层析、超滤除盐后得到电泳纯的SPase,纯化后的SPase的比酶活是原来的2.1倍,酶活回收率达到82.7%。经SDS-PAGE电泳测定,重组SPase的分子量约为59 kDa。该酶在不高于37℃,pH 6.0~6.7的条件下比较稳定,最适催化温度与最适催化pH分别为37℃,pH 6.7,该酶对蔗糖的米氏常数(Km)为7.3 mmol/L,最大反应速率(Vmax)为0.2μmol/(min.mg)。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物,利用重组SPase催化合成α-熊果苷。其最佳反应条件为:20%蔗糖,200 U/mL的酶液,1.6%氢醌,pH 6.0~6.5,25℃,反应21 h。α-熊果苷的摩尔产率为78.3%,α-熊果苷的产量为31 g/L。     

蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究

考察了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G123厌氧发酵产蔗糖磷酸化酶下游的分离纯化工艺.收集的菌体经超声破碎得到粗酶液,通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析分离后获得了电泳纯的蔗糖磷酸化酶,酶活回收率为31.7%,酶的分子量约为55.7 kD,纯化后的蔗糖磷酸化酶比活为115.3 U/mg.该酶在中性及偏酸性(pH5.5-8.0)情况下,酶稳定性较好,较报道的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-1149的pH稳定范围宽.同时该酶在37℃保存2 h,酶活几乎没有下降.利用获得的纯酶以氢醌和蔗糖为底物催化合成α-熊果苷,在23 U/mL的酶反应体系中,60%蔗糖、5%氢醌、pH7.5,37℃,反应12 h,氢醌转化率达到16.3%,α-熊果苷的产量为20g/L.     

高温乳糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)的β-半乳糖苷酶基因bgaB经克隆,测序后,转入大肠杆菌高效表达载体pET-20(b)中,重组菌在IPTG诱导下,表达出的重组蛋白比酶活量为6.66U/mg。比出发菌株高50倍。     

肠膜明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum)基因组DNA中扩增出了葡聚糖蔗糖酶基因dsrD并将其连接到表达栽体pET-30(a),得到重组质粒pET-30-dsrD,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的170kD特异蛋白条带出现.经测定酶活力达1.2U/mL,约是原始菌株的30倍.     

Lactobacillus casei磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的重组表达

以Lactobacillus casei染色体基因组为模板,PCR扩增获得磷脂酶A2基因pla2,以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒pET-28a(+)-pla2。通过IPTG诱导实现磷脂酶A2在E.coli DE3中的重组表达。对诱导条件初步优化后,重组菌酶活最大可达2.8 U/mL。通过Ni-螯合柱对目的蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析重组磷脂酶A2相对分子质量为1.7×104。通过酶学性质分析,最适温度为37℃,最适pH 8,比酶活为110 U/mg。     

两种耐热磷酸化酶的构建及高效催化合成红景天苷

目的:使用表达耐热蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Spase和耐热纤维二糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Cpase,发酵培养后粗酶液作为催化剂,以价格低廉的蔗糖为原料合成红景天苷。方法:分别构建耐热蔗糖磷酸化酶和耐热纤维二糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌,然后将重组菌、蔗糖、酪醇和磷酸混合,得到反应混合物,使反应混合物在45℃下转化,而产生红景天苷。结果:在耐热蔗糖磷酸化酶酶液1200 U/L、耐热纤维二糖磷酸化酶酶液500 U/L、蔗糖110 g/L、酪醇30 g/L和磷酸50 m M的浓度下,反应条件为pH 7.0、温度45℃、转速50转/分、反应时间32小时后,红景天苷浓度达到23.7 g/L。结论:本研究使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶联合催化的工艺,成功地高收率合成了红景天苷。同时,本研究构建的耐热磷酸化酶酶活高,处理简单,为拓展糖苷类似物的合成提供了一种新的方法。     

Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达

为了增加高热稳定性的葡萄糖异构酶的得率,采用PCR技术扩增得到Thermus thermophilusHB8葡萄糖异构酶基因xylA,连接到表达载体pET-22b( )上,获得重组质粒pET-22b( )-xylA。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测葡萄糖异构酶酶活。重组菌经诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子量约为44 kD特异性蛋白质条带,比酶活约为18.562 U/mg,比野生型菌株提高了2倍。     

乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达

以构建好的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/xylanase为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组蛋白的表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,乳糖作为诱导剂时,重组菌产酶活力33.9 U/mg略高于IPTG作为诱导剂时重组菌产酶活力28.10 U/mg,这为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产木聚糖酶提供了参考依据。     

嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究

旨为研究嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的生化特性,以嗜酸喜温硫杆菌TST3的基因组DNA为模板,PCR扩增出硫加氧还原酶基因(sor),构建了表达载体p ET-sor,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(p ET-sor2)。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导,该重组菌可以表达目的蛋白SOR。对诱导条件进行优化,并在最优的条件下诱导SOR酶表达,再经超声波破碎重组菌,上清液通过Ni+-NTA亲和层析柱纯化获得重组酶,其催化氧化反应的比酶活、Km值和Vmax分别为0.70U/mg,15.672×10-2 g/m L和12.755×10-5 mol/(L·min),而催化的还原反应的比酶活、Km值和Vmax分别为2.21 U/mg,0.507×10-2g/m L和4.876×10-5 mol/(L·min)。