铁皮石斛疫病及其病原菌

铁皮石斛疫病2001年发现在浙江义乌栽培田间,是由疫霉菌引起的。在田间,疫霉菌侵染茎基部,引起当年移植苗根腐、植株枯萎和死亡,但侵染2-3年植株幼嫩顶部仅引起顶枯症状。通过对病原菌形态学、交配型的观察,以及核糖体DNAITS序列分析,侵染铁皮石斛的5个分离菌株被鉴定为烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae。致病性试验表明,铁皮石斛是烟草疫霉菌的寄主。     

广西人工栽培铁皮石斛内生菌根的研究

通过光学生物显微镜及Qwin图像分析系统,对人工繁育栽培的铁皮石斛各生长期植株的内生菌根进行了观察分析。结果表明:铁皮石斛具有典型的内生菌根;铁皮石斛根内共生菌不是其原有的,而是通过栽培基质传与铁皮石斛的根而共生。被真菌侵染的区域大,其植株生长茂盛,真菌对铁皮石斛的生长发育可能有促进的作用。     

铁皮石斛锈病病原鉴定及药剂筛选

为了明确铁皮石斛锈病的病原菌种类,筛选其有效防治药剂,通过对云南瑞丽铁皮石斛种植基地调查,运用形态学并结合分子生物学方法对病原菌进行鉴定,选用4种杀菌剂进行田间药效试验。结果表明,铁皮石斛锈病由真菌鞘锈菌(Coleosporium sp.)引起,发生期为每年2～11月,鞘锈菌的夏孢子直接侵染铁皮石斛叶片,以冬孢子越冬。10%苯甲·丙环唑悬浮剂450 mL·hm-2与75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂300 g·hm-2的防效显著高于其他两种药剂,3次药后防效分别为82.16%和82.88%,这2种药剂可作为防治铁皮石斛锈病的有效药剂。     

一串红叶斑病的病原菌鉴定

一串红Salvia splendens叶斑病被发现在杭州市农科所栽培花卉的遮阳网大棚中,是由棒孢霉属真菌侵染引起的。在田间,病原菌侵染植株的茎和叶片,引起当年移植苗发生茎腐、落叶、植株枯萎和死亡。通过对病原菌形态学观察以及核糖体DNA ITS序列分析,证明侵染一串红的病原菌为决明生棒孢霉菌Corynespora cassiicola。致病性试验结果表明,一串红是决明生棒孢霉菌的寄主。种子带菌检验结果显示,种子带菌率仅为1%。     

硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响

利用盆栽的方式研究了不同硝酸镧水平(0、1.0、3.0、5.0和7.0mg·L-1)下接种兰科菌根真菌对铁皮石斛生物量、多糖和蛋白质合成的影响,并分析了叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的变化,以探讨硝酸镧和兰科菌根真菌对铁皮石斛生理特性的影响。结果表明:(1)添加适量的硝酸镧有利于菌根真菌侵染和菌根发育,提高铁皮石斛幼苗生物量。(2)在接种菌根真菌的同时添加5.0mg·L-1的硝酸镧,铁皮石斛的根重、茎叶重和总生物量均达到最大,分别是未添加硝酸镧以及未接种对照组的4.26倍、4.98倍和4.87倍,其菌根侵染率也高达92.8%;而且可显著提高叶片中叶绿素含量,并显著降低细胞内的丙二醛含量。(3)在适量(5.0mg·L-1)的硝酸镧水平下接种菌根真菌能促进铁皮石斛幼苗多糖和蛋白质的合成,并显著提高细胞内SOD、CAT和POD活性。研究认为,菌根真菌与适宜浓度硝酸镧(5.0 mg·L-1)联合使用能显著促进铁皮石斛菌根的形成,增强植株的生理活性和适应能力,提高其生物量和多糖等活性成分的积累,有效改善铁皮石斛的药用品质。     

同源四倍体铁皮石斛的生长及多糖积累

通过秋水仙素诱导铁皮石斛多倍体,以外观形态、气孔、染色体数目筛选多倍体植株,分析多倍化对铁皮石斛多糖累积及生长的影响。结果表明,同源四倍体铁皮石斛茎、叶及原球茎的多糖含量分别是二倍体的1.31、1．83及1．95倍,但生长速度显著或极显著低于对照。ISSR分析显示,同源四倍体植株产生较明显的基因变异。     

温度对铁皮石斛生长及生理特性的影响

通过不同温度下的控制实验,研究了铁皮石斛光合作用与生长对温度的响应,以期为铁皮石斛的栽培提供理论依据。温度对铁皮石斛的光合速率（Pn）有明显影响,30℃处理的植株具有最高的饱和光合速率（Pmax）,其较高的光合速率与RuBP电子传递速率与羧化速率间相对平衡有关。温度对铁皮石斛茎的生长及多糖含量有明显影响,20℃处理的石斛多糖含量显著性的高于其他两个处理,而茎长、茎节数、茎鲜重等则是在30℃下最高。结果表明,30℃的温度对铁皮石斛的光合作用较为适宜,但在20℃条件下植株具有更高的多糖含量。     

对增强辣椒疫霉菌抗性的研究

病原物诱导型启动子能精确控制抗病基因在侵染位点的表达,是抗病基因工程的有效工具。prp1-1是来自马铃薯谷胱甘肽巯基转移酶基因启动子的一个273bp的片段,能够快速准确地启动被侵染位点抗病基因的表达;Rs-AFP2是具有对致病性丝状真菌的广谱抗性。该研究构建prp1-1调控Rs-AFP2基因表达的载体,经农杆菌介导转化法导入辣椒。逆转录PCR检测发现,转基因辣椒只在受到疫霉菌孢子侵染时,才由prp1-1启动Rs-AFP2基因的转录。用疫霉菌孢子灌根接种转基因辣椒T1代植株,35株T1代辣椒中有29株表现出明显的疫霉菌抗性。另将23株T1代辣椒种于人工气候箱,发现其形态和发育特征与相同条件下的非转基因植株无明显区别。研究表明,prp1-1调控Rs-AFP2的诱导表达达到了增强辣椒疫霉菌抗性的目的,而且避免了负面效应的发生。     

哈密瓜疫病的病理解剖研究

以新疆厚皮甜瓜＂红心脆＂作为供试植株,甜瓜疫霉作为病原,对其在植物体内的侵染途径及对组织的危害进行了观察,结果为：（１）菌丝可穿过寄主表皮或通过表面伤口、自然孔口对茎蔓部、下胚轴进行侵染;（２）菌丝在寄主组织中蔓延时产生分枝,沿着细胞间隙或胞间层纵向或横向延伸,以纵向侵染速度快;（３）疫霉菌对寄主组织的危害是引起表皮、皮层、韧皮部和髓射线细胞变形直至收缩,在木质部导管中,菌丝及其侵染时所产生的絮状物、侵填体可单独或共同堵塞整个导管。     

辣椒疫霉RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性、基因转录特征及功能

【目的】分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能。【方法】本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl_2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化。【结果】PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子。该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降。【结论】RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子。     

铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析

为了揭示铁皮石斛(Dendrobium officinale)甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在甾醇代谢过程的功能,该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草(Nicotiana tabacum),并采用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达,采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示:(1)成功获得DoSMT2基因的开放阅读框(1 119 bp),并成功构建正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2,经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定,获得4株阳性转基因烟草植株。(2)Southern blot结果表明,4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带,而非转基因烟草植株没有,说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。(3)qRT-PCR检测显示,非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达,4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达,且表达水平差异极显著,各株系表达量高低依次为P3P1P2(P4)。(4)气相色谱质谱分析显示,转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片,而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片。研究表明,DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇转化形成24-亚乙基胆甾烯醇活性。     

肉桂醛对增强辣椒疫霉病抗性的作用机制研究

该实验以辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)致病性菌株NJ01和‘苏椒5号’辣椒幼苗为研究对象,通过肉桂醛对辣椒疫霉菌的体外抑菌作用、室内侵染效果以及对辣椒幼苗防卫反应的调控作用,揭示肉桂醛对增强辣椒疫霉病抗性的作用机制。结果表明:(1)肉桂醛对实验所用致病性菌株NJ01的抑制中浓度(EC50)值为0.81mmol/L;肉桂醛处理可导致NJ01菌丝严重皱缩、畸形、断裂;PI染色显示NJ01菌丝出现明显的细胞死亡现象。(2)单独NJ01菌株接种的辣椒植株表现出明显病症(茎基部变黑褐色、干枯萎缩,植株倒伏,叶片脱落,生物量下降);而肉桂醛处理2h后接种NJ01菌株的辣椒植株长势良好,无明显病症,鲜重和叶绿素含量显著上升至对照水平。(3)与单独接种NJ01菌株处理相比,肉桂醛处理2h后接种NJ01菌株的辣椒植株体内抗氧化酶(CAT、SOD、POD)活性显著上升,抗氧化物质(GSH和ASA)含量显著增加。研究认为,肉桂醛可能通过抑制辣椒疫霉菌的生长及其对辣椒植株的侵染能力,同时调控辣椒植株防卫反应,进而提高辣椒对疫病抗性。     

铁皮石斛不同授粉方式对蒴果发育及种子萌发的影响

为研究不同授粉方式对铁皮石斛蒴果发育以及无菌播种种子萌发的影响,选用健康的铁皮石斛植株花朵进行了自花授粉、异花授粉和自然授粉;选用不同种龄的种子在离体培养条件下进行萌发实验。研究结果表明:铁皮石斛自花授粉和异花授粉均能结实,异花授粉的结实率较高,达64.8%;铁皮石斛在开花的第2~3天授粉的结实率最高;120~210 d种龄的种子萌发率较高,均为90%以上。选择人工异花授粉和适宜种龄的种子离体培养,不仅可培育优良品种,还可缩短繁殖周期,为铁皮石斛遗传改良提供依据。     

铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用

由于人为的滥采滥挖和野外生境的退化, 使得铁皮石斛 (Dendrobium officinale) 这种名贵的中药材一直处于极度濒危的状态。为了从菌根真菌的角度给人工保育铁皮石斛提供理论指导, 对铁皮石斛的组织培养苗人工接种‘GDB181’菌株 (Epulorhiza sp.) 。培养60d后, 接菌苗平均鲜重增长率比对照苗高出了84.8%。在营养元素含量方面, 接菌苗的B、Si、Fe、Cu和Mn元素含量的净增率分别为780%、533%、192%、191%和128%, 均在100%以上;其他元素含量也有不同程度的增加 (除Zn外), 结果证明两者有效地建立了共生关系。在显微和超微结构的观察中发现:真菌菌丝随机破坏铁皮石斛的根被入侵到外皮层, 并从外皮层细胞不断扩展延伸到皮层的大型细胞, 最后在大型细胞中被分解消化。在真菌侵染过程中, 被侵染的皮层细胞的细胞壁严重扭曲变形, 菌丝在皮层细胞形成菌丝结, 菌丝结常位于细胞核附近或包围细胞核。在皮层的大型细胞中, 菌丝细胞被植物的溶酶体包围, 部分或全部被消解, 出现脱壁或失去细胞质甚至成为空腔等变化, 最终形成衰败的菌丝残骸, 溶酶体也随之消失。溶酶体分布越多的部位, 菌丝细胞消解变形越严重。含有菌丝残骸的皮层细胞可被新侵染的菌丝重新定殖, 这一菌丝侵染被消化再侵染的过程在铁皮石斛生长发育过程中可不断重复发生。     

辣椒疫霉效应分子RxLR121504功能特性的研究

辣椒疫霉菌Phytophthora capsici引起的辣椒疫病是世界性蔬菜病害,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌侵染寄主植物过程中常分泌大量的效应分子来促进自身的侵染与定殖,其中Rx LR效应分子在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。辣椒疫霉菌是一种重要的植物病原卵菌,本研究以辣椒疫霉菌标准菌株LT1534为材料,克隆鉴定了辣椒疫霉的一个效应分子,编号为Rx LR121504,然后将其构建至PBIN‐GFP2植物表达载体,利用农杆菌介导的瞬时表达技术、Western blot和亚细胞定位观察技术,较深入地开展了Rx LR121504功能特性的研究。结果表明,Rx LR121504能有效引起本氏烟寄主的过敏性坏死反应(HR),并对激发子INF1诱导的细胞坏死反应具明显的抑制效果,因此Rx LR121504可能参与了辣椒疫霉菌抑制寄主的免疫抗菌过程。但Rx LR121504对寄主植物的分子靶标尚未鉴定明确,该效应分子对寄主植物的分子机制有待进一步深入的研究。     

拮抗烟草疫霉的枝穗霉菌株筛选

【背景】烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的烟草黑胫病(tobacco black shank)是烤烟生产上重要的土传根茎病害之一,生产上防治困难。【目的】筛选对病原菌具有强拮抗能力的有益微生物菌株是开展生物防治的基础。【方法】采用平板对峙法筛选对烟草疫霉具有拮抗作用的枝穗霉菌株。根据枝穗霉在烟草疫霉菌落上的覆盖程度和产孢量,以及对烟草疫霉菌丝、孢囊梗和孢子囊的缠绕情况,将枝穗霉的拮抗能力划分为强、中等、弱和无4个等级。【结果】供试8种65株枝穗霉中,6株具有强拮抗能力、27株具有中等拮抗能力、22株具有弱拮抗能力、10株无拮抗能力;不同枝穗霉菌株对烟草疫霉的抑制率大小为20.0%-86.7%。【结论】粉红枝穗霉(Clonostachys rosea)菌株7901、11361和亚麻生枝穗霉(C. byssicola)5072、6729、7507及条孢枝穗霉(C. grammicospora)6730对烟草疫霉具有强拮抗能力,这为后续盆栽试验及作用机理研究等提供了种质资源。     

不同栽培条件辣椒疫霉菌ITS序列同源性分析

由疫霉菌引起的辣椒疫病是辣椒生产上的主要病害。明确设施栽培辣椒土传病害和露地栽培条件下辣椒疫病疫霉病菌基因序列和同源性,为制定病害防治措施提供依据。通过病菌形态观察、ITS基因序列测定与同源性分析开展研究。由疫霉菌侵染的辣椒病害在设施和露地不同栽培形式下发生部位略有不同,但在病菌形态上表现一致,ITS基因序列同源性极高,达到了99%以上。设施土传病害和露地栽培条件下辣椒疫病菌属于同一种,均为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)。     

不同产地铁皮石斛主要成分及甲醇提取物HPLC指纹图谱研究

本文采用紫外分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)测定铁皮石斛中总黄酮、多糖、柚皮素、石斛酚的含量,同时运用HPLC法建立霍山铁皮石斛及其他产地铁皮石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱并聚类分析。实验结果显示不同产地铁皮石斛的主要化学成分含量存在差异,5批霍山铁皮石斛的总黄酮、柚皮素、石斛酚含量较高,多糖含量较低。建立了霍山铁皮石斛的共有指纹图谱模式,5批霍山铁皮石斛具有极高的相似度,在92.6%~94.8%之间,浙江临安、浙江乐清、江苏盐城、云南昆明所产的铁皮石斛相似度在17.5%~41.5%之间。5批来自安徽霍山的铁皮石斛共有峰总面积较高,为9 827.40~14 102.28。其他产地铁皮石斛的共有峰面积在730.27~4 206.20之间,明显低于霍山铁皮石斛。聚类分析结果可分为两大类,安徽霍山为一类,其他产地为一类。霍山铁皮石斛与其他产地铁皮石斛存在一定差异,且小分子成分含量较高。上述结果为进一步研究霍山铁皮石斛化学成分提供参考,为铁皮石斛品质鉴别、质量控制及资源的综合利用提供实验依据。     

黄瓜不同抗病品种与疫霉菌相互作用的超微结构研究

电镜观察发现,黄瓜（ＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）的不同抗病品种在与疫霉菌（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｍｅｌｏｎｉｓＫａｔｓｕｒａ）的相互作用过程中有不同的表现。感病性品种易被疫霉菌侵染,被侵染的叶肉组织及周围细胞中胶层解离、胞质凝聚、细胞器解体,叶片组织内有大量胞间及胞内生长菌丝。中抗病性品种也被疫霉菌侵染,但表现出胞间连丝断裂、内质网和高尔基体增多等抗病性反应,与菌丝相接触的细胞出现质膜内陷。抗病性品种出现过敏性坏死反应,叶肉细胞与入侵菌丝一同解体死亡,胞间菌丝向细胞内穿透处形成壁附加物。中抗病性品种和抗病性品种在与疫霉菌的相互作用过程中表现出不同的抗性机制。     

珍稀濒危铁皮石斛的研究进展

铁皮石斛是我国传统名贵中药材,具有独特的药用价值和保健功效。从1950年代以来,人们掠夺式采挖野生铁皮石斛,导致现今铁皮石斛野生资源濒临枯竭。近十多年来,随着铁皮石斛研究工作取得的巨大进展,铁皮石斛相关产业也得到迅猛发展。为使今后进一步加强铁皮石斛野生资源保护和铁皮石斛产业健康可持续发展,该综述对近年来有关铁皮石斛的研究进行概述,并对铁皮石斛野生资源保护与资源开发利用中存在的问题进行探讨。