丙型肝炎病毒多表位DNA疫苗的研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是非甲非乙型肝炎的主要病原,目前还没有有效的预防和治疗手段。多表位DNA疫苗(multi-epitope DNA vaccine, minigenes/epigenes)是指通过筛选与组合优势抗原表位(包括T细胞、B细胞表位)基因,以能产生高效细胞、体液免疫应答进而清除HCV病毒为目的的新型核酸疫苗。其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导全面的机体抗病毒免疫应答,并尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响。本文介绍近年来国内外在丙型肝炎多表位DNA疫苗方面的研究进展,并展望了其发展方向。     

GM-CSF和IL-4增强Aβ表位DNA疫苗的免疫原性研究

目的:探究和评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)作为β淀粉样蛋白(Aβ)表位DNA疫苗的分子佐剂,增强DNA疫苗体液和细胞免疫反应的水平。方法:阿尔茨海默病DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T分别与重组DNA分子佐剂p VAX1-S-IL-4和p VAX1-S-GM-CSF联合免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。结果:分子佐剂IL-4组相比单独的DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T组抗体水平具有一定程度的提高;GM-CSF能明显提高DNA疫苗Aβ特异的抗体水平和泛DR辅助T细胞表位(PADRE)特异的细胞免疫反应,4次免疫后其抗体滴度提高了4倍。结论:GM-CSF佐剂能够有效地用于今后阿尔茨海默病DNA表位疫苗的研究中。     

共表达siRNA和hIL-12的新型乙肝多表位DNA疫苗的研究

目的 构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法 设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspH I位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的Mlu I位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hIL12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。结果 经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV 多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 pg/mL细胞上清,72 h检出量为1 712 pg/mL细胞上清;转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。结论 成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果。我们的工作为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。     

信号肽和辅助性T细胞表位增强HBV核心抗原DNA疫苗诱导的免疫应答

为增强HBVDNA疫苗的免疫效率 ,于HBV核心抗原 (HBcAg)基因 5′末端引入人IL 2信号肽和一个通用型辅助性T淋巴细胞表位基因 ,并构建成DNA疫苗 ,转染COS7细胞后经ELISA检测出分泌型HBcAg。通过肌肉注射途径分别将这种DNA疫苗和编码天然HBcAg的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,结果表明前者诱导细胞和体液免疫应答的强度均明显超过后者 ,且更趋向于T辅助细胞 1(Th1)型免疫应答 ,故其对慢性HBV感染的治疗可能有潜在的应用价值     

丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc). 将mfc与gst基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表位基因和mfc基因串联的候选HCV DNA疫苗, 即质粒pVAX1.0-st-mfc. 以GST-MFC蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠, 采用ELISA和Western blot方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV多表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征, 可作为HCV疫苗研制的候选基因.     

乙肝DNA疫苗的研究进展

核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究以DNA疫苗为主。乙肝DNA疫苗不仅能诱导机体细胞介导的体液免疫反应,而且还能诱导机体细胞介导的特异性细胞免疫反应,CTL活性增强,在乙型肝炎预防和治疗中具有广阔的应用前景。本文就近几年有关乙肝DNA疫苗的进展作了综述。     

人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定

为确定丹毒丝菌表面保护性抗原A的N-末端(SpaA-N)优势抗原表位,研发新型表位DNA嵌合疫苗,利用生物信息学软件对丹毒丝菌SpaA-N的优势B细胞抗原表位进行预测,以重叠PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白( HPV-16 LI) HI环结构的编码序列中,构建获得重组嵌合质粒pcDNA3-HPV-LI -△spaA.该重组质粒经体内、外瞬时特染后,RT-PCR均扩增获得了1 500 bp左右的目的片段.免疫印迹试验显示,体外转染嵌合质粒的细胞总蛋白能够与GST-SpaA-N重组蛋白免疫血清在56 kD处产生特异性结合.ELISA分析显示嵌合质粒可在小鼠体内产生差异显著的特异性抗体(P＜0.01),抗体滴度为1:1 000.此外,pcDNA3-HPV-L1-△spaA制备的抗血清至少可在1∶10稀释度条件下,介导外源补体对半数以上的菌体进行杀伤.该研究表明,获得的SpaA-N表位DNA嵌合疫苗具有免疫活性,为研发安全有效的丹毒丝菌新型DNA疫苗提供了一个新思路.     

生物信息学方法预测病原体抗原蛋白序列中多肽疫苗候选表位

根据病原体抗原基因中具有免疫原性的表位氨基酸序列,通过化学合成技术可制备该病原体的多肽疫苗。相较于灭活和减毒疫苗,多肽疫苗因成分简单、特异性强、安全性高、易于保存等优点成为疫苗研发的重点。然而,特异有效的疫苗候选表位的预测和筛选,仍是限制多肽疫苗设计与研发的一个重要因素。本研究综合多个生物信息学工具,构建了一个可用于预测和筛选病原体多肽疫苗候选表位的操作流程。并且,基于严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)的结构蛋白序列,该流程被成功地应用于其候选抗原表位的预测和筛选。最终,我们共筛选到34条关于SARS-CoV-2的T细胞候选表位,其中20条候选表位与数据库中经过验证的表位高度同源,且能够被T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别。综上所述,本研究不仅为当下广泛蔓延的SARS-CoV-2的多肽疫苗设计提供了候选表位,还建立了一个广泛适用于多肽疫苗候选表位预测和筛选的工作流程。     

疫苗研制的新方法

<正>免疫学和细胞生物学的最新进展使现有的疫苗得到改进已有可能,甚至在将来可获得抗复杂生物体如寄生虫的疫苗。 应用现代技术如单克隆抗体,目前有可能鉴定保护性表位(能够诱导保护性免疫应答的抗原决定簇),应用化学方法或DNA重组技术,可在实验室内得到这些表位。然而,这些潜在疫苗中的大多数不能够刺激充     

流感病毒NP表位序列增强H7N9 HA DNA疫苗免疫效果研究

为增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,本文构建了含有流感病毒NP的5个重复优势T表位或B表位(包括B_1线性表位和B_2构象表位)的表达质粒(简称NPT和NPB),以小鼠为动物模型,将NPT和NPB分别与H7N9流感病毒HA DNA混合免疫BALB/c小鼠1次,21 d后用致死剂量(20 LD_(50))的H7N9流感病毒攻击小鼠。通过检测免疫后小鼠血清特异性抗体滴度和攻毒后的免疫保护性指标-存活率、肺部残余病毒滴度及体重丢失率,评价表位质粒与HA DNA疫苗混合免疫对小鼠的保护效果。试验结果表明:用致死性H7N9流感病毒攻击小鼠后,HA DNA组小鼠全部死亡,HA+NPT免疫组小鼠存活率达到100%,HA+NPB1和HA+NPB2免疫组,小鼠存活率分别为30%和75%;混合免疫HA+NPT后小鼠抗体滴度升高明显,攻毒后小鼠体重丢失明显降低。综上表明,含有5个NP优势T表位或B表位的表达质粒能增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,混合免疫一次可以使小鼠得到较好的保护。HA DNA和表位疫苗的混合免疫,节约了疫苗用量,降低了免疫成本,为流感病毒核酸疫苗的临床开发提供了一定的试验基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.