优良面包酵母菌株的杂交育种

本文对实验室保存的面包酵母进行筛选,以不加糖面团发酵力最高的菌株BY-14和高糖面团发酵力最高的菌株BY-6作为两杂交亲本.二倍体菌株经过单倍体制备、分离和筛选后,利用群体杂交方法,获得了一株兼备两亲本优良性能的面包酵母菌株,其不加糖面团发酵力达到菌株BY-14水平,且高糖面团发酵力比菌株BY-6提高了25%.     

优良面包酵母菌株的杂交育种

本文对实验室保存的面包酵母进行筛选, 以不加糖面团发酵力最高的菌株BY-14和高糖面团发酵力最高的菌株BY-6作为两杂交亲本。二倍体菌株经过单倍体制备、分离和筛选后, 利用群体杂交方法, 获得了一株兼备两亲本优良性能的面包酵母菌株, 其不加糖面团发酵力达到菌株BY-14水平, 且高糖面团发酵力比菌株BY-6提高了25％。     

pSH-CUP重组质粒的构建及面包酵母酸性海藻糖 酶基因的敲除

设计含有与面包酵母(Saccharomyces cerevisiae BY-6)编码酸性海藻糖酶ATH基因内部部分序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除单元,转化面包酵母获得G418阳性克隆.将铜抗性基因(cuP1-MT1)导入Cre重组酶表达质粒pSH47,得到重组质粒pSH-CUZ,并转化阳性克隆,以铜抗性筛选面包酵母转化子.半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因.重组质粒pSH-CUP的构建,不仅解决了酵母转化子筛选标记问题和非酵母基因的引入,而且使LoxP-kanMX-loxP基因敲除体系在进行真核生物基因敲除时更加方便可行.     

SSU1多拷贝表达对酿酒酵母二氧化硫生成量的影响

【目的】在不影响酵母正常代谢前提下,构建亚硫酸盐分泌量提高的基因工程菌株,增加二氧化硫生成量,有效地解决啤酒老化问题。【方法】以适量高产二氧化硫工业啤酒酵母突变株M8总DNA为模板,PCR方法得到带有不同长度5′端非编码区的基因片段SSU1-1、SSU1-2,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352构建表达载体pSU1和pSU2,转化实验室酵母YS58,验证SSU1多克隆表达对其二氧化硫生成量的影响。进而将pSU2转化工业啤酒酵母M8,利用亚硫酸盐抗性筛选转化子,并对其二氧化硫和硫化氢生成量及其啤酒抗老化性能进行测定和分析。【结果】实验室酵母转化子pSU1-4和pSU2-3二氧化硫生成量较原株明显提高而硫化氢生成量基本不变,工业啤酒酵母转化子Y2二氧化硫生成量比原株M8提高74.4%,TBA值下降14.9%,DPPH自由基清除率提高38.2%,硫化氢生成量基本不变。【结论】SSU1基因的多拷贝表达有效提高了亚硫酸盐转运蛋白Ssu1p表达量,增加了亚硫酸盐分泌量,啤酒抗氧化能力得到明显增强,而对酵母硫代谢途径中亚硫酸盐还原为硫化物代谢过程没有影响。     

面包酵母细胞出芽率与产品质量关系研究

速用压榨酵母(Compressed yeast,CY)和活性干酵母(Active dry yeast,ADY)是用于面点制作的主要两类酵母产品。发酵力则是其共同质量指标。目前,国产压榨酵母的发酵力波动很大,活性干酵母不仅发酵力低,而且保质期短。面包酵母的发酵力定义为由一定数量的酵母样品,面粉和水制成的面团在恒温下产生CO_2的能力。本文采用Burrows法测量面包酵母发酵力,面团由0.15克干酵母,20克面粉和15mol脱离子水混合而成,并以该面团在30℃、180min内产生的CO₂总量作为发酵力的表征,文献^[2]表明,面包酵母的发酵力与终细胞群体中的带芽细胞分率(Fraction of budding cells,FBC)有密切的关系,传统的概念是,为提高酵母产品质量,FBC越低愈好。经研究发现,压榨酵母的耐贮存力及活性干酵发酵力与FBC成反比,但对速用压榨酵母而言,其发酵力FBC的正相关关系甚为明显,这与传统有着根本的差异。     

毕赤酵母中外源表达脂肪酰-CoA还原酶生产脂肪醇

【目的】通过在毕赤酵母Komagataella pastoris GS115中外源表达来源于霍霍巴[Simmondsia chinensis(Jojoba)]的脂肪酰-Co A还原酶Jojoba FAR,利用微生物发酵生产脂肪醇。【方法】以质粒p RL105为模板PCR扩增获得霍霍巴脂肪酰-Co A还原酶的编码基因,以p GAPZαA为载体构建重组表达质粒p GAP-far,并通过电转化法转入K.pastoris GS115,筛选转化子并发酵,气相色谱-质谱联用检测发酵产物。【结果】构建了毕赤酵母重组菌株p GAPZ-far-GS115,通过摇瓶发酵检测到脂肪醇的合成。随后在7 L规模的发酵罐上发酵验证,得到脂肪醇产量为134.74 mg/L,产率为1.22 mg/(L·h)。【结论】实现了脂肪醇在毕赤酵母中的生物合成,为工业上利用毕赤酵母生产脂肪醇奠定了一定基础。     

木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

细菌血红蛋白基因在产D-阿拉伯糖醇酵母菌中的克隆与表达

构建了含透明颤菌血红蛋白基因vgb和甲醛抗性基因SFA1的重组质粒pVgb EX2 ,转化到产D 阿拉伯糖醇的酵母Saccharomycessp.X 62中。转化子细胞中VHb的含量比对照菌细胞有显著提高 ,表明基因vgb在酵母细胞中得到表达。转化子发酵的D 阿拉伯糖醇产量与转化率均有提高。在重复实验中D 阿拉伯糖醇的产量最多提高了 2 7 3%。在实验条件下 ,似乎D 阿拉伯糖醇的产量与细胞VHb含量有相关性。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）,但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.