GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

鸡importin β1基因的克隆及生物信息学分析

[目的]对鸡importin β1基因进行克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的鸡importin β1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importin β1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和系统进化树进行分析。[结果]鸡importin β1基因CDS全长2 268bp,共编码755个氨基酸,该蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importin β1蛋白含有丰富的二级结构,以α-螺旋为主(占64.90%)。importin β1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。[结论]鸡importin β1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

MARVELD1调控内含子miR-186、miR-335表达的研究

目的:前期研究发现,MARVELD1(具有囊泡运输和膜连接功能的MAL及相关蛋白1)在多种肿瘤细胞中表达下调,许多micro RNAs也随其发生变化。本研究探讨了MARVELD1调控mi R-186和mi R-335的表达方式。方法:本研究选取了多种肺癌细胞系,运用q RT-PCR的方法检测了MARVELD1以及mi R-186和mi R-335的表达情况,通过MARVELD1过表达体系和si RNA干扰MARVELD1表达的体系分析mi R-186和mi R-335表达变化情况,运用生物信息学网站对mi R-186和mi R-335进行分析,确认其是否为内含子mi RNA,并进一步应用MARVELD1过表达和RNAi体系检测MARVELD1对mi R-186和mi R-335的宿主基因的影响。结果:在肺癌细胞中,MARVELD1与mi R-186、mi R-335的表达呈现明显的正相关。在过表达MARVELD1之后,mi R-186、mi R-335出现高表达;当下调MARVELD1表达时,mi R-186、mi R-335则表现低表达。生物信息学分析发现mi R-186和mi R-335均为内含子mi RNA。进一步分析MARVELD1与mi R-186和mi R-335宿主基因的表达关系显示,MARVELD1可以上调它们的宿主基因的表达。结论:上述结果表明,MARVELD1可通过影响内含子mi R-186和mi R-335的宿主基因进而调控二者的表达,为进一步研究MARVELD1影响肿瘤细胞的发生机制奠定了基础。     

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白（PreS1）在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用．为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离. 结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75)．通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用．实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究．     

胰岛素增强子结合蛋白-1（ISL1）与肿瘤的发生与发展

在人类发育过程中,胰岛素增强子结合蛋白-1(ISL1)被认为是一个胚胎性基因。成年后,ISL1只在特定的组织或器官中表达,例如胰腺和大脑。近年来,在多种肿瘤中检测到ISL1的异常表达,不仅在胰腺内分泌肿瘤、神经肿瘤中高表达（与之相应的正常组织也表达ISL1）,而且在淋巴瘤、胃癌和膀胱癌等肿瘤组织中呈现表达（其正常组织不表达ISL1）。ISL1的异常表达可能与肿瘤的发生发展及预后相关。本文针对ISL1与肿瘤的相关性以及在肿瘤发生发展中的功能进行综述,为进一步的分子机制研究提供理论依据。     

巨噬细胞迁移抑制因子分子机制研究进展

巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是一类多效性的前炎症细胞因子,能够促进其他多种前炎症因子的分泌或表达。其基因在大多数哺乳动物基因组中具有90%的同源性。MIF启动子区含有能够与多种转录因子结合的DNA结合位点,同时含有与其表达水平相关的多态性位点。MIF发挥其生物学功能,一方面可以通过非受体介导的内吞作用,实现MIF与c-Jun激活结构域结合蛋白-1（JAB1）的相互作用;另一方面,受体依赖型的MIF能够激活包括PI3K/AKT、MAPK和G蛋白偶联受体相关的信号传导途径等。此外,MIF还能够通过直接或间接方式调节肿瘤抑制基因p53的功能。MIF已经被证实参与调解炎症、肿瘤生成和纤维化等生物学过程。从MIF表达、相关受体、涉及的信号通路与生物学过程等方面,对其分子功能的研究进展进行了总结,并对MIF相关的分子机理进行了综述,旨在为MIF相关疾病的诊断和治疗提供线索。     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

POMP与SuFu相互作用调控Hedgehog信号通路的活性

Hedgehog信号通路在胚胎发育、组织再生中发挥重要的作用,且与癌症发生发展密切相关. 其胞内调控组分Suppressor of Fused（SuFu）蛋白通过结合转录因子Gli(s),负调控该信号通路,但其作用的分子机制仍不甚清楚. 在本项研究中,以人SuFu作为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术成功地筛选到1个新的相互作用因子-蛋白酶体成熟蛋白（POMP）. 通过免疫共沉淀、体外GST pull-down和免疫细胞化学实验验证其相互作用. 为了探究POMP与SuFu的相互作用对Hedgehog信号通路的影响,构建了POMP的过表达质粒和干扰质粒（miR-RNAi）以及转录因子Gli活性检测系统,即荧光素酶报告基因法,结果显示,过表达SuFu蛋白时POMP正调控Hedgehog信号通路,而下调POMP的表达则抑制Gli的活性. 该研究结果揭示了POMP新的生物学功能,为阐明Hedgehog信号通路的具体分子机制提供了新的线索.     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

膜联蛋白A1及其与肿瘤关系的研究进展

膜联蛋白A1 (Annexin A1,ANXA1)是一种来源于脊柱(哺乳)动物的钙依赖性磷脂结合蛋白,是介导细胞内糖皮质激素抗炎作用的效应分子,在组织中广泛表达,参与细胞生长周期的各个阶段.其既可以可溶性形式存在,也可稳定或可逆结合于细胞骨架蛋白,调控细胞与细胞外基质的相互作用.大量的研究发现,AnnexinA1的表达在不同肿瘤组织中有差异,并且同一肿瘤不同类型中表达也不一样,其异常表达及细胞内定位改变可能跟多种恶性肿瘤的分化及转移相关.Annexin A1与肿瘤的密切关系,或许可使其发展为一个新的肿瘤标志物,为肿瘤的早期诊断、治疗及预后提供新的判断标准.因此,探讨Annexin A1与肿瘤的关系极具临床应用前景.     

4-1BBL通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人胃癌细胞的增殖和迁移

4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL),又被称为CD137和CD137配体,分别属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和配体家族的成员。4-1BBL 与4-1BB相互作用可以激活T细胞免疫应答。因此,4-1BBL一直在抗肿瘤免疫应答中发挥经典的免疫共刺激分子作用。近期研究发现,4-1BBL在肿瘤细胞中另有其他的生物学功能,但4-1BBL在胃癌进展过程中的功能尚不明确。本文探讨了4-1BBL在人胃癌细胞中的生物学功能和分子作用机制。首先,通过检索TCGA和Kaplan Meier plotter数据库发现,4-1BBL在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.001）,且4-1BBL的高表达与胃癌的不良预后正相关（P<0.05）。细胞生物学的结果显示,敲除4-1BBL明显抑制胃癌细胞的增殖（P<0.05）、侵袭和迁移（P<0.05）,促进胃癌细胞的凋亡（P<0.05）;另外,蛋白质免疫印迹结果表明,敲除4-1BBL可使β-联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白质表达水平下降,抑制Wnt/β-catenin信号通路。相反,过表达4-1BBL则显著促进胃癌细胞增殖（P<0.05）、侵袭和迁移（P<0.05）,减少胃癌细胞的凋亡（P<0.05）;且过表达4-1BBL促进β-联蛋白(β-catenin)、c-Myc和细胞周期蛋白D1的蛋白质表达,激活Wnt/β-catenin信号通路。综上所述,4-1BBL可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人胃癌细胞的增殖和迁移。     

Importin β1介导的病毒蛋白入核转运在病毒复制中作用的研究进展

核转运受体蛋白importinβ1是输入蛋白importinβ家族重要成员之一,它是一种相对保守的、广泛分布于真核生物细胞内的核转运受体蛋白。许多研究表明,importinβ1能直接识别和结合含有不同类型核定位信号的病毒蛋白并转运其入核,此过程对病毒的整个复制和致病进程起着十分重要的作用。该文主要从importinβ1的结构特征、介导的病毒蛋白入核转运机制以及在病毒复制中的作用、药物阻断importinβ1参与的病毒复制等研究方面进行综述,以期为后续研究病毒蛋白细胞核定位的分子机制和功能以及抗病毒治疗提供参考。     

细胞因子和生长因子信号转导途径中信号蛋白分子的核转运机制

信号蛋白分子的入核及出核转运是细胞因子和生长因子信号转导途径中的重要环节.核定位序列（NLS）是信号蛋白分子上与入核转运相关的氨基酸序列.核孔复合物（NPC）、核转运蛋白importin和能量供应体Ran/TC4在入核转运过程中也发挥了重要作用.另外,很多细胞因子和生长因子或其受体上所含有的NLS序列也具有核定位功能,并可能通过“伴侣机制”参与其他信号蛋白分子的入核转运.     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

iTRAQ联用串联质谱鉴定食管鳞状细胞癌差异表达蛋白质及蛋白质相互作用网络

基于质谱的蛋白质组学结果不仅具有重复性差和覆盖率低等缺陷,并且针对数十至百个差异表达蛋白质分子的分析非常具有挑战性,而蛋白质与蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network, PPIN）分析能够在一定程度上弥补上述不足,使各种组学研究结果具有一致性和可比性。本研究应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）联用串联质谱技术鉴定了与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）相关的差异表达蛋白质244个（ESCC中,升高和降低的蛋白质分别为119个和125个）,基因本体论（gene ontology, GO）富集与肿瘤十大特征相关的17个GO条目|以该17个条目包含的117个蛋白质为种子蛋白搜索STRING（http: //www.string-db.org）数据库,构建包含96个存在相互作用的PPIN和21个离散蛋白质。用CytoHubba算法确定34个中心节点蛋白质和36个瓶颈蛋白质,非重复49个中心节点和/或瓶颈蛋白质中含7个目前已报道的癌基因表达蛋白（PPP2R1A、CTNNB1、ENO1、EZR、TPM4、COL1A1、TPM3）,确定与该7个癌蛋白直接相互作用的4个蛋白质（FN1、ITGB1、TAGLN和YWHAZ）可能为参与食管癌变的关键蛋白质,并应用Western印迹实验验证了 FN1、ITGB1、TAGLN和YWHAZ等4个关键蛋白质在ESCC中具有显著的表达差异,表明PPIN分析是确定具有重要生物学意义分子的有效途经之一。     

PDIA1和EF1D在左侧和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的：初步确定蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1-delta为左侧和右侧结肠癌中差异表达蛋白,为左侧和右侧结肠癌在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法：收集人左侧结肠癌（LSCC）和右侧结肠癌（RSCC）组织标本,进行二维凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定左右侧结肠癌中差异表达蛋白质,进一步应用RT—PCR、WesternBlot和免疫组织化学技术检测蛋白质二硫化畀构酶A1和延伸因子1-delta在左侧和右侧结肠癌中的表达状态。结果：筛选并成功鉴定出左侧和右侧结肠癌中16种差异表达蛋白质,与右侧结肠癌比较,lO种蛋白在左侧结肠癌表达上调,6种蛋白在左侧结肠癌表达下调,其中蛋白质二硫化异构酶A1在左侧结肠癌中表达上调,延伸因子1-delta在左侧结肠癌中表达下调,并通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化方法证实了在左侧和右侧结肠癌中该两种蛋白表达的差异,与蛋白质组学结果一致。结论：左侧结肠癌和右侧结肠癌的蛋白质组存在差异,其中蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1—delta在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是左侧和右侧结肠癌生物学行为差异的原因。     

免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白

为了进一步阐明G蛋白β亚基2样1蛋白（guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP）在普萘洛尔（propranolol,PRO）生物学效应发生机制中的作用,采用免疫共沉淀法结合液相色谱-芯片-离子阱串联质谱（HPLC-CHIP-IT-MS/MS）系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中的GBLP相互作用蛋白.结果表明,有7种蛋白与GBLP存在相互作用,分别为酪蛋白α-S1、酪蛋白α-S2、β酪蛋白、桥粒芯蛋白1前体、α-烯醇化酶、果糖二磷酸醛缩酶C、硫氧还原蛋白过氧化物酶2.这些蛋白的生物信息学检索结果提示,GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关.     

基于ChIP-Seq进行肿瘤睾丸抗原XAGE-1b基因表达蛋白的DNA结合位点鉴定

XAGE-1b（X antigen family member 1B）属于XAGE亚家族,是一种肿瘤 睾丸抗原（cancer/testis antigen,CTA）,表达于正常人睾丸组织和多种类型的肿瘤细胞中.本实验室前期研究发现,该基因在涎腺腺样囊性癌高转移细胞系中呈高表达.为了进一步研究XAGE-1b下游调控基因,本实验采用ChIP Seq技术筛查XAGE 1b蛋白质可能存在的DNA结合片段. 结果发现,XAGE-1b下游调控基因富集于细胞分裂（cell division,P-Value＝7.95e-04）、细胞周期调控（cell cycle,P-Value＝5.532e-03）、及癌症相关基因（GESA/MSigDB module_11,P-Value＝2.010e-06）中．同时发现,XAGE-1b下游调控多个基因的表达产物（NCBI/interactions 22827,P-Value＝4.678e-06）能与原癌基因c-Myc的启动子抑制蛋白PUF60发生蛋白质相互作用,并通过qPCR进行了验证．这些研究对阐明XAGE-1b在肿瘤细胞的增殖和转移中的作用有重要意义.     

人类免疫缺陷病毒1型与细胞间的相互作用

自从发现人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体后,人们对HIV-1与人体相互作用的过程进行了深入研究.通过研究发现了HIV-1与机体相互作用的多种机制,例如HIV-1主要侵犯人体以CD4 T细胞为主的表达其结合表位(如CCR5和CXCR4)的免疫活性细胞[1].目前研究者在正常机体内发现多种物质与HIV-1致病有关.例如APOBEC蛋白(人体内主要为APOBEC3G),当HIV-1侵入机体后,该蛋白表达减少,这一过程在HIV-1的致病过程中发挥重要作用.通过对这些蛋白或分子的研究,进一步揭示了HIV-1的致病机制,为治疗HIV感染/AIDS提供了新思路.同时不同的HIV-1感染细胞模型的构建为AIDS的研究提供了多种工具.     

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（hTNFR1）基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1,电转到Escherichia coli BL21（DE3）表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明,在hTNFR1的N端融合NusA标签后,hTNFR1的可溶性有一定提高;在NusA-hTNFR1基础上,过表达了7种分子伴侣,筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,可溶性表达量约占总量的90％;对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签,结合Western blot分析鉴定,获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。