谷氨酸棒杆菌SYPS-062 L-丝氨酸脱水酶活性分析及其基因敲除对L-丝氨酸积累的影响

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) SYPS-062基因组DNA为模板,扩增得到L-丝氨酸脱水酶(L-SerDH)的编码基因sdaA。将其克隆到表达载体pET-28a(+),并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,对纯化的L-SerDH进行了酶活测定,并与来自C.glutamicum ATCC13032的重组L-SerDH进行了比较,结果显示,两种不同菌株来源的重组L-SerDH降解L-丝氨酸的酶比活力差异并不显著。在此基础上敲除菌株SYPS-062 的sdaA基因,探讨该基因对C.glutamicum SYPS-062生长及产酸的影响。通过构建自杀型重组质粒pK18mobsacB-△sdaA,电击转入C.glutamicum SYPS-062中,以同源重组的方式获得了sdaA基因缺失突变株,并用PCR方法对突变株C.glutamicum SYPS-062△sdaA进行了验证。与出发菌株相比,突变菌株生长缓慢,单位菌体L-丝氨酸的产量(Y_P/X)提高了15.13%。     

不同来源的谷氨酸棒杆菌氨基脱氧分支酸合成酶的活性分析

分别以高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062与模式菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032的基因组DNA为模板,运用PCR技术扩增出氨基脱氧分支酸合成酶(ADC synthase)的编码基因pabAB。实验结果表明：来源于SYPS-062和ATCC 13032的pabAB片段全长均为1863bp,编码620个氨基酸。两片段存在16个碱基的差异,引起了7个氨基酸的突变。将pabAB连接表达载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a-pabAB,并转化E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下,E.coli BL21(DE3)(pET-28a-pabAB)高效表达分子量约为67kDa的可溶性蛋白。表达产物带有His-tag标记,选用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后酶活测定结果表明,来源于SYPS-062氨基脱氧分支酸合成酶的比酶活低于ATCC 13032达46.6%。     

氨基脱氧分支酸合成酶对Corynebacterium glutamicum SYPS-062积累L-丝氨酸的影响

为阐明氨基脱氧分支酸合成酶(ADC合成酶)在Corynebacterium glutamicum SYPS-062体内积累L-丝氨酸过程中的作用,通过交叉PCR以及同源重组的方法敲除叶酸途径关键酶ADC合成酶的编码基因pabAB,构建了叶酸缺陷型菌株Corynebacterium glutamicum SYPS-062△pabAB,同时构建pabAB基因增强表达重组菌C.glutamicum SYPS-062(pJC Ⅰ-pabAB).分别考察了ADC合成酶对菌株生长的影响、对L-丝氨酸降解途径关键酶丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的影响以及其对L-丝氨酸积累的影响.结果表明,与出发菌株相比,增强表达基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力提高了33%.SHMT酶的酶活力提高了30%,其最大比生长速率(μm)提高了48%,单位细胞产酸率(Yp/x)降低了36.2%;而敲除基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力降低了61%.SHMT酶的酶活力降低了20%,最大比生长速率降低了32%,单位细胞产酸率提高了12%.     

产L-丝氨酸菌株SYPS-062的鉴定及碳源对发酵的影响

采用形态学、生理生化实验和16S rDNA序列分析的方法对从自然界中筛选得到的一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸菌株SYPS-062的分类地位进行了研究, 确定其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。同时考察了碳源对菌株SYPS-062发酵产L-丝氨酸的影响, 实验结果表明, 当蔗糖浓度为60 g/L时, 菌株SYPS-062生物量和L-丝氨酸的积累均达到最大值, 分别为8.1 g/L和6.6 g/L。     

维生素对谷氨酸棒杆菌SYPS-062直接发酵合成L-丝氨酸的影响

研究了VB1,生物素,VB6,VB2,叶酸和VB12对一株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）SYPS-062直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的影响,并且初步分析了这几种维生素对菌株SYPS-062发酵积累L-丝氨酸的调控机制。添加一定量的生物素,VB1和VB6表现出对L-丝氨酸积累分别为35%,28%和11%的促进;添加VB2实现了L-丝氨酸和生物量的等幅提高;而叶酸和VB12则通过促进菌株SYPS-062中1C单元循环的效率使L-丝氨酸的积累量分别提高了39%和82%,并且实现了产物转化率（YP/S）及单位细胞产率（YP/X）的显著提高。将六种维生素在其分别的最优浓度下复配,添加在发酵培养基中,结果发现发酵周期有6 h左右的缩短,并且达到的最大生物量及L-丝氨酸的积累分别为11 g/L和9.0 g/L。     

谷氨酸棒杆菌ilvE基因的敲除对相关氨基酸合成的影响

L-缬氨酸是谷氨酸棒杆菌SYPS-062发酵生产L-丝氨酸的主要副产物.为减少L-缬氨酸的积累,利用基因重组技术敲除SYPS-062转氨酶B编码基因ilvE内部的987 bp核苷酸序列,构建了ilvE基因缺失突变株SYPS-062△ilvE.研究表明,重组菌ilvE基因的缺失直接导致了分支氨基酸(Val、Ile、Leu)的合成能力的降低,影响了菌体的生长,其中Ile成为生长限制性因子,在培养基中添加分支氨基酸能明显促进其生长.重组菌培养96 h,发酵液中L-缬氨酸含量低于0.5 g/L,与出发菌株相比,其生成率降低90％.     

谷氨酸棒杆菌SYPS-062合成L-丝氨酸的代谢通量分析

以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料直接产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum SYPS-062为研究对象,考察了一碳单元循环中的辅因子—叶酸和维生素B12对菌株生长、蔗糖消耗及L-丝氨酸生成的影响,同时对处于对数生长期的菌株进行了代谢流量分析。结果发现,添加扰动因子叶酸和维生素B12对磷酸戊糖途径(HMP)碳流影响较大,碳源主要用于细胞生长及合成能量,而流向目的产物L-丝氨酸的碳流减少。同时在添加维生素B12时,增大了G3P节点的L-丝氨酸合成途径的分流比,但造成三羧酸循环(TCA)的流量不足,需要大量回补,从而限制了产物合成速率的进一步提高。     

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）标准菌株ATCC 13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因（hom）,在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km）,得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g- hom::Km -8发酵60小时赖氨酸产量达到4.7 g／L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（0.7 g／L）的6.7倍。     

glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶

glyA基因广泛存在于生物体中 ,其编码的丝氨酸羟甲基转移酶 (serinehydroxymethyltransferase,SHMT)催化丝氨酸和甘氨酸之间的相互转化 ,转化反应产生的 5,1 0 亚甲基四氢叶酸 (M THF)提供细胞新陈代谢—碳单位 ,此反应在细胞新陈代谢中处于重要地位。因此 ,研究 glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶具有重要的意义。介绍了 glyA基因的克隆、序列分析、调控组分和丝氨酸羟甲基转移酶的部分性质。     

甲醇利用菌SDM11中glyA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

对甲醇降解菌Methylobacterium.sp SDM11中的glyA基因进行克隆及特性研究,以获得更多的丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)资源。根据GenBank中已报道的Methylobacterium extorquensAM1中的glyA基因序列(登录号:L33463)设计引物,以SDM11的基因组DNA为模板,PCR扩增glyA基因。利用pETblue-2载体将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达。PCR扩增到一个1.40 kb大小的DNA片段,经过blast软件比对分析,发现该片段与已报道的Methylobacterium extorquensAM1的glyA基因的序列相似性为95%,氨基酸序列的相似性为98%。该基因编码468个氨基酸,预测的分子量大小为52.2 kD,等电点为7.02,发现纯化后的目标蛋白具有SHMT酶活性,并初步测定了酶活力。     

Mycotoxin production from fungi isolated from grapes

AIMS: In order to assess the potential for producing mycotoxins, fungi were isolated from wine producing grapes. METHODS AND RESULTS: The isolates were identified and Penicillium expansum, the most well recognized mycotoxin producer, was analysed for mycotoxin production by TLC. Many of the strains produced patulin and/or citrinin, often depending on whether they were grown on a grape or yeast extract sucrose media. CONCLUSION: Citrinin was produced by all strains grown in the yeast extract sucrose medium, but only one strain (from 51) was able to produce this compound in grape juice medium. Patulin was produced in the yeast extract medium by 20 strains and in grape juice medium by 33 strains. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The presence of mycotoxins in wine producing grapes is discussed. Grapes contamination with patulin seems not to contribute to wine contamination, and no ochratoxin producing fungi was identified.     

Diterpenes derived from clerodanes from Pulicaria angustifolia

The investigation of Pulicaria angustifolia afforded, in addition to known triterpenes and caryophyllene epoxide, four methyl esters of diterpenes, all derived from clerodane. Three of them are derivatives of seco-nidoresedic acid. The structures were elucidated by spectroscopic methods.     

Chemiluminescence from an erythrocyte folic acid oxidase from normal individuals and from cancer patients

Folic acid oxidase from erythrocytes oxidatively cleaves folic acid at the C-9-N-10 bond to yield pterin-6-aldehyde and p-aminobenzoyl glutamic acid, with the concomitant generation of singlet oxygen. The emission from singlet oxygen is proportional to the enzyme activity. DABCO was used as a singlet oxygen emission enhancer to increase the sensitivity of the measurement. In general, pregnant women show high enzymatic activity, but the emission is strongly quenched by DABCO. This is contrary to normal and cancer cases in which an increase in the emission was observed. This effect is larger in cancer cases. These results are presented as a potential method for detecting physiological and pathological human conditions.