冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞iNOS、TLRs表达以及凋亡的影响

冠蛋白-1(Coronin-1)在真核细胞中广泛表达,涉及钙离子稳态、细胞骨架动力学、免疫及炎症反应等多种细胞功能。该研究探讨了冠蛋白-1不同表达水平对巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达和凋亡的影响并探讨其分子机制。根据冠蛋白-1表达水平的差异,实验细胞分为RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus 3组。各组细胞分别经4μmol/L钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(cyclosporin A,Cs A)处理24 h或2μmol/L肌动蛋白聚合抑制剂松胞菌素D(cytochalasin D,cyt D)处理48 h,同时设未处理对照,再分别用Real-time PCR法检测iNOS m RNA水平,Western blot法检测细胞TLR2、TLR4、TLR9及钙调磷酸酶(calcineurin,Ca N)的蛋白质水平,流式细胞术检测细胞凋亡百分率。各组细胞用四甲基异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)染色后,计算纤维型肌动蛋白(F-actin)重排率。结果显示,冠蛋白-1过表达细胞相对于冠蛋白-1正常表达细胞,其iNOSm RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡率均显著降低(P0.05);Cs A作用后,RAW264.7-Cor.Plus的iNOS m RNA水平以及TLR2、TLR4、TLR9蛋白质水平和细胞凋亡率均较未处理对照细胞显著增加(P0.05),RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus细胞的Ca N水平较未处理对照细胞显著降低(P0.05);cyt D作用后,与未处理对照细胞相比,iNOS m RNA水平及细胞凋亡率无显著性差异(P0.05),但TLRs的表达显著降低(P0.05);经鬼笔环肽染色后,RAW264.7-Cor.Plus细胞F-actin重排率显著高于RAW264.7细胞(P0.05)。以上结果表明,冠蛋白-1过表达不仅促进了巨噬细胞F-actin重排,而且下调了iNOS、TLRs水平并且抑制细胞凋亡,其分子机制与冠蛋白-1促进钙调磷酸酶调控的Ca~(2+)信号通路有关。     

巨噬细胞冠蛋白-1 siRNA对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)逃逸免疫杀伤有关。该研究探讨了p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒靶向抑制巨噬细胞Coronin-1表达后对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。用该质粒转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,采用RT-PCR法和Western blot检测质粒转染前后细胞Coronin-1的表达水平。以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)分别感染转染质粒组细胞和对照组细胞,通过细胞内细菌菌落计数和细胞爬片抗酸染色法评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力;利用流式细胞术检测转染质粒组细胞及对照组细胞吞噬耻垢分枝杆菌后不同时段的细胞凋亡水平。结果显示,该质粒能显著抑制RAW264.7细胞Coronin-1的m RNA水平及蛋白表达水平;感染耻垢分枝杆菌6 h后,转染质粒组细胞内细菌数显著高于对照组细胞(P0.05);感染耻垢分枝杆菌48 h后,转染质粒组细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P0.05)。以上结果表明,p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒能显著抑制巨噬细胞Coronin-1的表达,并可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为开发靶向巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗措施奠定基础。     

分枝菌酸诱导巨噬细胞泡沫细胞化对细胞自噬的影响

研究分枝菌酸(mycolic acid,MA)诱导的巨噬细胞泡沫细胞化对巨噬细胞自噬的影响,探讨MA促巨噬细胞泡沫细胞化的机制。构建LC3真核表达质粒(p EGFP-LC3B),转染RAW264.7细胞后获得其稳定转染细胞株(RAW264.7/p EGFP-LC3B);用MA诱导RAW264.7/p EGFP-LC3B获得RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞。实验分为三组:RAW264.7细胞组、RAW264.7/p EGFP-LC3B细胞组及MA诱导的RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组。通过RT-PCR法检测各组细胞中自噬相关基因Becn1、LC3B的转录水平,Western blot法检测各组细胞自噬标志蛋白LC3B II/I的表达水平。RTPCR检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组的Becn1基因及LC3B基因的转录水平明显较其他两组低(P0.05)。Western blot检测结果显示,RAW264.7/p EGFP-LC3B泡沫细胞组LC3B II/I比值明显较其他两组低(P0.05)。由此可见,当巨噬细胞被MA诱导成为泡沫巨噬细胞后,其自噬功能显著降低。该研究证明,MA可能通过抑制巨噬细胞自噬,引起脂代谢失衡,进而发生巨噬细胞泡沫细胞化。     

nAChRα1调控尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用研究

目的:探讨nAChRα1是否参与调节尼古丁促进巨噬细胞RAW264.7增殖迁移的作用。方法:将体外培养的RAW264.7细胞分4组为:(1)正常对照组;(2)尼古丁组;(3)对照干扰+尼古丁组;(4)nAChRα1干扰+尼古丁组。用尼古丁(5 ng/mL)刺激巨噬细胞RAW264.7,特异性nAChRα1 si RNA用脂质体3000转染细胞,CCK-8法检测尼古丁处理3 h、24 h和48 h后细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Western blot和RT-PCR检测细胞内nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA的表达情况。结果:与空白对照组相比,尼古丁可显著促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,增加nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达;而在干扰nAChRα1表达后,尼古丁诱导的RAW264.7细胞的增殖和迁移明显被抑制,且细胞nAChRα1、MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达均显著的降低。结论:nAChRα1可介导尼古丁促进RAW264.7细胞的增殖和迁移,这可能与其参与调控尼古丁增加RAW264.7细胞分泌MMP-2、MMP-9有关。     

结核分枝杆菌分泌蛋白EspB 在RAW264.7细胞中的稳定表达

[目的]建立能够稳定表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白EspB(Rv3881c)的RAW264.7细胞系,为研究EspB蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用提供科学依据.[方法]首先成功构建的重组质粒pEGFP-C1-EspB,然后将重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blot方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定.[结果]EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,成功获得了能够稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系.[结论]本试验利用脂质体介导的方法,将构建的重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1转染至Raw264.7细胞系中,获得了稳定表达EGFP-EspB融合蛋白的巨噬细胞系,为阐明EspB分泌蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用以及EspB与巨噬细胞蛋白之间的相互作用提供了研究平台.     

广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用受体TLR4和TLR2的影响

确定广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用受体,探索广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫调节机制。采用MTT法测定不同浓度广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响,筛选出促进巨噬细胞增殖能力最强的浓度。用筛选出的β-D-葡聚糖浓度作用巨噬细胞RAW264.7;TLR4抗体和TLR2抗体分别作用巨噬细胞RAW264.7 1h,再用含有β-D-葡聚糖的细胞培养液培养。收集细胞培养上清和细胞,检测细胞培养上清中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量;提取细胞内总RNA,采用RT-PCR测定巨噬细胞TLR4 mRNA表达量;提取巨噬细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹western blot测定TLR4的蛋白表达。广叶绣球菌β-D-葡聚糖能够促进巨噬细胞RAW264.7增殖,增加NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量,提高TLR4 mRNA表达和蛋白表达,差异极显著（P<0.01）。TLR4抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量明显下降,差异极显著（P<0.01）。TLR2抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量下降,但差异不显著。广叶绣球菌β-D-葡聚糖可以通过细胞表面受体TLR4激活信号转导通路,增强下游细胞因子的释放,从而调节巨噬细胞RAW264.7的免疫功能。TLR2可能不是广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫受体。     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

过表达Daintain促进RAW264.7细胞增殖和吞饮功能

[目的]研究过表达Daintain对巨噬细胞RAW264.7增殖和吞饮功能的影响。[方法]培养RAW264.7细胞,脂质体法导入过表达Daintain的质粒(pc DNA-DT)和空质粒(pc DNA),经G418筛选单克隆细胞株。Western Blot检测稳定转染细胞株中Daintain的表达,MTT法检测Daintain过表达对RAW264.7细胞增殖的影响,中性红染色法检测Daintian过表达对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响。[结果]1对比转染pc DNA质粒的细胞株,转染pc DNA-DT质粒的细胞株中Daintian表达量增加28.7%,说明成功建立稳定过表达Daintian的RAW264.7细胞株;2在48h和72h,相对转染pc DNA的细胞株,转染pc DNA-DT的细胞株增殖明显增强;3在0.1和1μg/m L LPS诱导下,相对转染pc DNA的细胞株,转染pc DNA-DT的细胞株的吞饮作用增强。[结论]过表达Daintain促进RAW264.7细胞增殖和吞饮功能。     

甘草酸对巨噬细胞抗绵羊肺炎支原体感染的调控作用研究

为观察甘草酸在小鼠巨噬细胞系RAW264.7抗绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)感染中的作用,实验利用CCK-8细胞活性检测找到最佳甘草酸处理浓度;检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞活性的影响。流式细胞仪检测甘草酸对RAW264.7巨噬细胞生长周期的影响;ELISA检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞分泌TNF-α的影响;Western blot检测细胞凋亡因子Bax、Bad的表达情况。RT-PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达情况。结果显示,浓度为12μmol/L的甘草酸显著升高RAW264.7的活性(P=0.012 9),且处于G1期的细胞数减少,G2期的细胞数增加。甘草酸(12μmol/L)可提高受MO感染的RAW264.7的增殖率(P=0.034 0),培养上清中TNF-α含量升高(P=0.015 2),巨噬细胞中促凋亡蛋白Bax表达量增加,但基因caspase 3和caspase 9的表达量显著下调(P<0.000 1),自噬相关基因Atg 7和Beclin 1表达量显著升高(P<0.000 1)。结果提示在MO感染巨噬细胞引起免疫抑制的情况下,甘草酸可通过促增殖、抑凋亡、促进TNF-α的表达、增加自噬来起到免疫调控作用。     

LOX-1特异性小发夹RNA 表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

[摘　要]　目的：靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。方法：(1)采用DNA重组技术,将LOX-1 shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）,半定量逆转录聚合酶链反应法检测LOX-1 mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达。(2) Ox-LDL诱导巨噬细胞建立泡沫细胞模型, LOX-1-shRNA进行干预,干预组使用脂质体法进行细胞转染,转染24小时后,再加入Ox-LDL作用24小时,用油红O染色法及细胞内游离胆固醇及总胆固醇测定法观察对泡沫细胞形成的影响,倒置荧光显微镜观察转染LOX-1 shRNA后RAW264.7细胞对Dil-ox-LDL的摄取率。结果：测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体;靶向LOX-1基因的发卡样shRNA表达载体转染RAW264.7细胞后,其LOX-1基因和蛋白表达显著下调, 同时可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成及对Dil-ox-LDL的摄取。结论：成功构建了能有效抑制LOX-1 mRNA表达的发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体,并在一定程度上能抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供理论基础。     

稳定表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的RAW264.7细胞系的建立

为研究结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis分泌蛋白ESAT-6 (Early secreted antigenic target of 6 kDa) 对巨噬细胞相关功能的影响,将正确构建的重组质粒pEGFP-C1-ESAT-6和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-ESAT6融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blotting方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定。结果证实EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,为后续的ESAT-6调控巨噬细胞机理研究提供了平台。     

红毛五加多糖单一组分AHP-Ⅲ对巨噬细胞的免疫调节作用及其机制

探讨红毛五加多糖(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharide)单一组分AHP-Ⅲ(Acanthopanax giraldii Hams polysaccharideⅢ)对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的激活作用及机制。不同浓度AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞,中性红试验检测细胞吞噬能力;ELISA和Griess法检测其IL-6、TNF-α和NO的释放量;RT-qPCR检测iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平;Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平。在实验浓度范围内,AHP-Ⅲ可显著增强RAW 264.7细胞的吞噬能力(P<0.05);促进RAW 264.7分泌NO、TNF-α和IL-6(P<0.05或P<0.001);并显著增加RAW 264.7细胞中IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量,呈剂量依赖性;Western blot结果表明,AHP-Ⅲ作用RAW 264.7细胞后,NF-κB中的p65、IKKβ、IκBα磷酸化水平明显升高。结果显示红毛五加多糖AHP-Ⅲ对小鼠巨噬细胞RAW 264.7具有显著激活作用。     

双特异性磷酸酶5过表达/干扰RAW264.7细胞株建立及其对自噬调控的影响

为探究双特异性磷酸酶5(dual-specificity phosphatase 5,DUSP5)在巨噬细胞RAW264.7自噬中的调控作用,该研究采用慢病毒转染的技术方法建立DUSP5过表达/干扰RAW264.7细胞株,并用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)分别对其进行刺激,使用蛋白免疫印迹技术(Western blot)、荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)、单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色以及免疫荧光等方法探究过表达或抑制DUSP5后对巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。结果显示:DUSP5过表达/干扰慢病毒转染RAW264.7可显著提高/抑制DUSP5 m RNA和蛋白的表达量(P0.01);Rapa刺激后,过表达DUSP5抑制自噬相关蛋白Beclin1和LC3II表达且自噬体形成减少,而抑制DUSP5表达结果与此相反;用Baf A1阻断DUSP5干扰RAW264.7稳定转染细胞株自噬流,DUSP5干扰RAW264.7稳定转染细胞株中LC3II表达量和自噬体数量均显著上调(P0.01)。由此说明,DUSP5参与调控巨噬细胞自噬,可能通过抑制自噬体合成来阻碍巨噬细胞自噬进程。此结论为进一步探究巨噬细胞自噬调控机制提供了新的研究思路。     

miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。     

Fucoidan对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

目的观察褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)对巨噬细胞RAW264.7体外吞噬活性、细胞因子TNF-α和IL-6分泌,以及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响。方法实验分对照组,Fucoidan高、中、低剂量组(浓度分别是200、400和800μg/mL)。药物处理6~48h后,MTT法检测RAW264.7细胞活力;中性红比色法检测细胞吞噬活性;ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-6的分泌水平;实时定量PCR检测Toll样受体4(TLR4)mRNA表达量。结果与对照组相比,Fucoidan显著增强RAW264.7细胞代谢活力和吞噬能力(P0.01),增加TNF-α和IL-6的分泌,上调TLR4的表达,呈剂量依赖关系。结论 Fucoidan可上调TLR4表达,增强巨噬细胞代谢和吞噬活性,增加TNF-α和IL-6的分泌,具有潜在的调节免疫作用。     

斗米虫蛋白体外抗肿瘤活性及其对小鼠巨噬细胞免疫调节作用

该文主要为了研究斗米虫蛋白的体外抗肿瘤活性及其免疫调节作用。提取斗米虫总蛋白,逐级盐析分为3个部分,透析除盐后得到不同蛋白部位,并采用SDS-PAGE检测斗米虫不同蛋白部位的分子量;利用MTT法、流式细胞术等方法研究斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC和小鼠乳腺癌细胞4T1增殖、迁移和凋亡的作用。MTT法研究斗米虫蛋白对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和人脐静脉内皮细胞HUEVC增殖的影响;荧光微球吞噬实验检测斗米虫蛋白对RAW264.7细胞吞噬能力的影响;Griess法检测对RAW264.7细胞释放NO能力的影响;ELISA法检测对RAW264.7细胞的IL-6、TNF-α和IL-1β分泌量;RT-PCR法检测不同浓度的斗米虫蛋白作用后RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ、TRL-4、IL-6以及4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平变化。结果显示,斗米虫蛋白主要分子量集中于63 kDa,斗米虫蛋白对人胃癌细胞MFC及小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖表现出较好抑制作用,并呈现出一定剂量依赖关系(P<0.05),对HUEVC细胞没有细胞毒性,对RAW264.7细胞表现出较好的促进增殖的作用(P<0.05)。斗米虫蛋白实验组与正常组细胞相比可以抑制4T1细胞的迁移(P<0.01),可诱导MFC和4T1细胞凋亡(P<0.05);斗米虫蛋白能够提高RAW264.7细胞的吞噬活性、NO释放量、TNF-α、1L-1β和IL-6分泌量及TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ和IL-6细胞因子的mRNA水平以及能显著下调4T1细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1 mRNA水平(P<0.05,P<0.01)。由此推论,斗米虫蛋白具有较好的体外抗肿瘤活性并且具有潜在的免疫调节作用。     

热休克预处理对TNF-α诱导的RAW264.7巨噬细胞迁移的影响

热休克反应是机体中一个重要的内源性保护机制,但其对TNF-α诱导的单核/巨噬细胞迁移有无影响目前尚不清楚.采用酶联免疫吸附实验观察TNF-α(20μg/L)刺激RAW264.7巨噬细胞4h后炎症因子IL-1β、IL-6、IL-15的表达情况;Western blot验证热休克预处理诱导热休克蛋白表达的增加;利用细胞趋化实验观察热休克预处理(42℃,1h)对TNF-α所致巨噬细胞迁移的影响.研究发现,TNF-α可明显促进RAW264.7细胞株中IL-1β、IL-6、IL-15等炎症因子的释放;热休克预处理诱导热休克蛋白HSP70、HSP90、HSP25表达增加;细胞趋化实验发现TNF-α处理的RAW264.7细胞迁移能力较正常对照组明显增强,而热休克预处理组巨噬细胞的迁移能力较单纯TNF-α处理组明显减弱.上述结果表明,热休克预处理抑制TNF-α所致巨噬细胞的迁移.     

人参根提取物增强巨噬细胞RAW264.7的自噬水平并提高其增殖和吞噬能力

研究人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7的增殖能力、吞噬能力和自噬水平的影响以及其相关性。用细胞计数试剂(CCK-8)检测不同浓度的人参根以及加入对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响;采用中性红吞噬实验检测人参根提取物对巨噬细胞吞噬活性的影响;采用吖啶橙染色法(AO染色法)检测自噬体的形成;采用免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3B、ATG7的表达变化以及自噬通路相关蛋白AMPK、AKT、mTOR及ULK1磷酸化的变化。引入自噬诱导剂rapamycin和自噬抑制剂CQ探讨人参根提取物影响细胞自噬与细胞增殖、吞噬能力的相关性。结果显示,与空白对照组比较,各组人参根提取物可促进巨噬细胞RAW264.7的增殖及吞噬作用;参根提取物能够增加巨噬细胞RAW264.7酸性自噬体的数量,提高LC3B、ATG7的表达、增加AMPK和ULK1的蛋白磷酸化水平,时降低AKT,mTOR的磷酸化水平。Rapamycin进一步增强巨噬细胞的增殖以及吞噬能力,而CQ则减弱了人参根提取物所引起的巨噬细胞的增殖以及吞噬能力提高。以上结果表明人参根提取物可能通过增强巨噬细胞RAW264.7的自噬水平,提高其增殖和吞噬能力,具有激活巨噬细胞增强机体免疫力的潜在作用。     

LncRNA-GAS5对BCG感染小鼠巨噬细胞后细胞坏死的调控作用

【背景】LncRNA-GAS5是由Gas5基因编码的功能性LncRNA分子,对细胞极化、细胞凋亡、坏死和自噬等多种生物学过程具有重要的调控作用。【目的】探讨LncRNA-GAS5对卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7坏死的调控作用。【方法】构建LncRNA-GAS5的过表达及干扰载体,分别转染巨噬细胞RAW264.7后使用BCG感染,采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞存活率,通过透射电镜观察细胞坏死形态,利用碘化丙啶(Propidine iodide,PI)单染法流式细胞仪检测细胞坏死率,通过实时荧光定量PCR和Western blot法研究坏死相关调控因子RIP1、RIP3和MLKL的表达水平。【结果】BCG感染巨噬细胞后,LncRNA-GAS5表达水平显著上调;同时,采用LncRNA-GAS5过表达载体单独转染或结合BCG感染后,巨噬细胞存活率均下降且细胞坏死率显著增加。同时坏死关键调控因子RIP1、RIP3和MLKL的mRNA及蛋白表达水平均显著上调(P0.001),而GAS5干扰载体可有效抑制这一效果。【结论】LncRNA-GAS5通过上调坏死相关因子RIP1、RIP3及MLKL的表达促进BCG感染巨噬细胞后诱导的细胞坏死,研究结果为进一步探讨LncRNA-GAS5对BCG感染巨噬细胞后细胞坏死调控的分子机制奠定了基础。     

Rig-I对LPS诱导的巨噬细胞增殖、凋亡及功能的作用研究

该研究旨在探讨维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene I,Rig-I)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞增殖、凋亡和细胞因子分泌等生物学功能的影响及其作用机制。以不同剂量的LPS刺激Rig-I基因沉默和过表达的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞,采用CCK-8和流式细胞术检测细胞的生长状态,采用q PCR方法检测细胞因子TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6相关基因的表达水平,并采用Western blot方法检测LPS诱导的TLR4信号通路的相关蛋白表达水平。CCK-8和流式细胞术结果显示,Rig-I促进巨噬细胞的增殖并抑制LPS诱导的细胞凋亡;q PCR结果表明,Rig-I促进巨噬细胞中TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6基因的表达。进一步的实验证实,Rig-I通过激活AKT及其下游蛋白p-38、NF-κB和Bcl-x L等抑制细胞凋亡并促进细胞因子的表达。该研究首次证实了Rig-I可通过AKT信号通路对LPS诱导的巨噬细胞增殖、凋亡及功能进行调节。