斑马鱼胚胎发育过程中TGF-1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。       

斑马鱼akt3 基因的克隆及其表达图谱与过表达分析

采用RT-PCR 和RACE 相结合的方法, 克隆得到了斑马鱼的akt3/pkb 基因, 其cDNA 全长为2874 bp,编码479 个氨基酸。斑马鱼akt3 具有akt 家族成员间保守的PH 结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守的磷酸化位点Thr305 和Ser472。与已发表的人、大鼠、小鼠的akt3 氨基酸序列比较, 相似性分别为95.8%、94.7%和95.4%。对斑马鱼早期胚胎进行RT-PCR 检测显示, akt3 在0-4hpf(hours post fertilization)含量水平较高, 6hpf 到12hpf 降低至较低水平, 16hpf 后表达量开始逐渐上升, 60hpf 至96hpf 则稳定在较高水平。原位杂交结果表明: akt3 在2hpf 至96hpf 的胚胎中整体都有表达, 没有组织特异性。在成鱼中, 除鳃部外, akt3 在所检测的其他各组织器官中均有表达, 在脑部和卵巢表达量较高; 利用显微注射持续表达myr-akt3 mRNA 研究其功能充分性时结果显示, 过量表达斑马鱼akt3 mRNA 能使斑马鱼胚胎发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3 注射组发育至24hpf 时观察(以排除akt3 造成的发育延迟的影响), 发现注射过akt3 的斑马鱼胚胎的脑部厚度较对照组显著增大, 表明akt3 对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。       

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼咽弓发育过程中作用的研究

叶酸缺乏可导致胚胎先天性发育异常,二氢叶酸还原酶是叶酸生物学作用通路中的关键因子,其功能阻抑将抑制叶酸生物学作用的发挥.咽弓是脊椎动物胚胎发育中头面部结构、心脏流出道等的共同前体.在模式生物斑马鱼中,利用基因表达阻抑以及过表达技术,探讨二氢叶酸还原酶基因(DHFR)在斑马鱼咽弓发育过程中的作用.石蜡切片以及软骨染色结果显示,DHFR表达阻抑导致斑马鱼咽弓以及腭发育明显异常,而DHFR过表达可部分挽救上述发育异常表型.TBX1和HAND2在咽弓发育中有重要作用.通过胚胎整体原位杂交以及Real-timePCR技术检测TBX1和HAND2表达水平.DHFR表达阻抑后TBX1和HAND2的表达降低,DHFR过表达可使TBX1和HAND2的表达增加.上述结果表明,DHFR在斑马鱼咽弓发育过程中扮演重要角色,DHFR通过影响TBX1和HAND2的表达而调控咽弓的形成和分化.     

Sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究sema(semaphorin)4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达.方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的sema4d RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究sema4d在斑马鱼早期发育过程中的表达.结果:成功合成sema4d基因探针,获得sema4d基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:sema4d在0.75 hpf(hours post fertilization)、1.0 hpf、1.5 hpf、12 hpf前普遍性表达;17 hpf开始至24 hpf在头部表达较多,在脊髓、肌肉、中间细胞群ICM(intermediate cell mass)区处有特异性表达区处有特异性表达;48 hpf在头部和躯干肌肉持续表达.结论:Sema4d在早期参与了造血的发生,在脑部,脊髓,肌肉的发育中可能起到了重要作用.     

小鼠ERb 基因片段的克隆及其在胚胎发育中的表达

为探讨ERb在小鼠胚胎发育过程中的表达, 首先设计ERb引物并扩增ERb基因片段, 构建ERb/pGEM-3Z重组质粒进行克隆, 分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切得到线性化DNA片段, 以Sp6和T7聚合酶合成地高辛标记的(dig )正、反义RNA探针。然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ERb 在小鼠胚胎中的表达。运用该探针检测到ERb 基因在10.5 dpc胚胎的脑、脊神经管、生殖脊、心包、肢芽及颌弓部位表达, 在13.5 dpc胚胎的端脑、中脑、延髓、脊髓、肢芽中表达。推测ERb基因可能在小鼠胚胎性别分化过程中起调节作用; 可能在小鼠胚胎神经管的早期区域化过程中起作用并在3个原始脑泡进一步分化及脊髓的分化过程中起作用; 可能在小鼠胚胎肢芽中的骨与软骨的形成与分化中起调控作用; 可能在小鼠胚胎心脏发育过程中起作用, 可能在小鼠胚胎颌弓的表面分化过程中起调控作用。     

Tbx1基因功能下调影响斑马鱼Tbx20和Tbx2表达

目的采用吗啡啉修饰反义寡核苷酸显微注射方法下调斑马鱼Tbx1基因表达,研究斑马鱼Tbx1基因功能下调对其他两个T盒基因Tbx20和Tbx2表达的影响。方法采用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸显微注射方法抑制斑马鱼Tbx1基因表达,分别将2.5、5、8、10 ng吗啡啉反义寡核苷酸在斑马鱼0-4细胞期注入胚胎,并构建Tbx20,骨形成蛋白2b（Bmp2b）和Tbx2反义RNA探针,进行整体原位杂交,观察Tbx1基因下调对Tbx20、Bmp2b及Tbx2表达的影响。结果Tbx1吗啡啉寡核苷酸显微注射组胚胎表现出鳃弓、耳囊、心血管系统和胸腺的发育异常。Tbx1基因下调导致Tbx20的表达出现改变,Tbx20在心脏的表达与对照组相比明显下调,神经元的表达范围明显缩小;Tbx1基因功能下调会导致Bmp2b在心脏和咽囊的表达减低,Bmp2b在后部咽囊的表达较前部咽囊减低得更为明显;Tbx1基因功能下调胚胎,Tbx2在鳃弓的表达模式发生改变,48 hpf,Tbx2在鳃弓的表达出现从后向前逐渐减低,鳃弓的表达范围较对照组明显缩小。结论Tbx1在发育过程中,会对其他T盒基因,如Tbx20和Tbx2具有激活或抑制的调控作用。Tbx1对Tbx20的作用可能是通过影响Bmp2b的途径,继发地影响Tbx20的表达。Tbx1基因功能下调,会改变Tbx2在鳃弓的表达模式。     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用

目的观察二氢叶酸还原酶基因(DHFR)功能阻抑斑马鱼胚胎的颅脑部发育情况,初步探讨二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用。方法采用显微注射吗啡啉修饰的反义核苷酸(MO)的方法进行DHFR表达阻抑。胚胎发育至受精后48hpf观察胚胎的颅部发育情况,在60hpf时经石蜡切片进一步观察胚胎的脑发育状况。利用胚胎整体原位杂交的方法检测影响神经系统发育的关键因子ngn1和huc的表达情况。结果显微注射MO可成功的进行DHFR表达阻抑。DHFR表达阻抑组胚胎存在颅脑部发育明显异常和ngn1、huc的表达强度明显减弱,且与显微注射的MO剂量呈正相关。结论DHFR在斑马鱼颅脑发育中有重要作用;其功能阻抑可导致胚胎颅脑部发育异常,其机理与ngn1和huc的的表达减弱有关。     

整体原位杂交检测ERα基因在小鼠胚胎发育中的表达

为制备地高辛标记的小鼠雌激素受体a(ERa)RNA探针,用其研究ERa在小鼠胚胎发育过程中的表达.通过RT-PCR,获得ERa基因片段,构建ERa/pGEM-3Z重组质粒,分别用Hind Ⅲ和EcpRI进行酶切得到线性化DNA片段,以17和sp6聚合酶合成地高辛标记的正反义RNA探针,然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ERa在小鼠胚胎中的表达.结果构建了ERa/pGEM-3Z质粒,获得高效价的正反义digERaRNA探针.运用该探针检测到ERa在10.5 dpc胚胎的前脑、脊神经管、生殖嵴、肢芽及颌弓中表达,在13.5 dpc胚胎的端脑、中脑、脊髓、肢芽及生殖系统中表达,为进一步研究ERa在小鼠胚胎发育中的功能打下了基础.     

斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究

实验对血红素加氧酶1（HO1）在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1 mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。       

草鱼两个肌肉生长抑制素cDNA克隆、表达及过量表达对胚胎发育的影响

肌肉生长抑制素(MSTN)是抑制肌肉生长和发育的重要生长调控因子.通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆草鱼MSTN-1型和MSTN-2型全长cDNA.RT-PCR分析结果表明,MSTN-1在草鱼肌肉、脑和眼中的转录量较高,在肝胰脏、脾脏和心的转录量较低,在肠、腮、性腺和肾中无表达;MSTN-2只在脑和肌内中有表达.在草鱼胚胎发育的0-36 hpf期间,MSTN-1的转录量较低;在胚胎发育的36-48 hpf期间,其转录量呈逐渐升高的趋势;MSTN-2各时相均无表达,可能因为该基因在草鱼胚胎发育过程中不起重要作用.通过分别显微注射MSTN-1型和MSTN-2型mRNA至斑马鱼1-2细胞期胚胎.结果显示,注射MSTN-1型mRNA过表达可导致斑马鱼体节发生期胚胎的前-后轴拉长,背-腹轴变短,脊索轻微扭曲,以及体节发育受到强烈抑制而不分化等现象.注射MSTN-2型mRNA胚胎早期发育有所延迟并未发生明显变化,但发育至60h之后尾部明显发生严重弯曲.     

微小染色体维系蛋白3基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:制备地高辛标记的微小染色体维系蛋白3(MCM3)基因的RNA探针,研究MCM3在斑马鱼早期发育中的时空表达。方法:收集并固定受精后24 h时期的野生型斑马鱼胚胎,提取总RNA,制备DIG标记的MCM3 RNA反义探针,整胚原位杂交,研究MCM3在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果:斑马鱼的MCM3氨基酸序列与小鼠、人具有高度同源性,通过不同时期胚胎的原位杂交,发现MCM3在早期发育过程中普遍性表达,胚胎受精后0~2 hMCM3在增殖性区域泛表达,受精后14~22 h在中枢神经系统、发育未成熟的眼部、体节及增殖性区域表达,受精后24 h在血液、中枢神经、翼板中脑、视觉盖及增殖性区域表达,受精后48 h在头部及肛门增殖性区域表达。结论:明确了MCM3在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,证明其与早期斑马鱼发育细胞增殖密切相关,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

Expression analysis of zebrafish membrane type-2 matrix metalloproteinases during embryonic development

Membrane tethered matrix metalloproteinases (MMPs) cleave a variety of extracellular matrix (ECM) and non-ECM targets and play important roles during embryonic development and tumor progression. Membrane tethered MMPs in particular are important regulators of both tissue invasion and morphogenesis. Much attention has been given to understanding the function of human and mouse MMP14 (also called membrane type-1 MMP, MT1-MMP) and our own data have linked zebrafish Mmp14 to the regulation of gastrulation cell movements. However, less is known regarding the expression and function of other membrane tethered MMPs. We report the cloning and gene expression analysis of zebrafish mmp15a and mmp15b (MT2-MMP) during early embryonic and larval development. Our data show that mmp15a exhibits limited expression prior to segmentation stages and is first detected in the tectum and posterior tailbud. At 24hours post-fertilization (hpf) mmp15a localizes to the caudal hematopoietic tissue, pectoral fin buds, and mandibular arch. By contrast, mmp15b is strongly expressed during gastrula stages before becoming restricted to the polster and anterior neural plate. From 24 to 48hpf, mmp15b expression is detected in the pharyngeal arches, fin buds, otic vesicle, pronephric ducts, proctodeum, tail epidermis, posterior lateral line primordia, and caudal notochord. During the larval period beginning at 72hpf, mmp15b expression becomes restricted to the brain ventricular zone, pharyngeal arches, pectoral fins, and the proctodeum. Many of the mmp15-expressing tissues have been shown to express genes encoding components of the ECM including collagens, fibronectin, and laminins. Our data thus provide a foundation for uncovering the role of Mmp15-dependent pericellular proteolysis during zebrafish embryonic development.     

TBX1, a DiGeorge syndrome candidate gene, is inhibited by retinoic acid

Both retinoic acid (RA) and Tbx1 are definitively indispensable for the development of the pharyngeal arches. The defects produced by a loss of Tbx1 highly resemble those induced by hyper- and hypo-RA. Based on these similarities, the effects of RA on Tbx1 expression pattern were explored during pharyngeal arch development in zebrafish. Whole-mount in situ hybridization and real-time quantitative PCR were used. Zebrafish embryos were treated with 5 x 10(-8)mol/L and 10(-7)mol/L RA at 12.5 hours post fertilization for 1.5 hours, respectively. Whole-mount in situ hybridization showed that Tbx1 was expressed in the cardiac region, pharyngeal arch and otic vesicle between 24 hpf and 72 hpf in zebrafish. Tbx1 expression was obviously reduced, even lost, in the pharyngeal arch and outflow tract in RA treated groups. Real-time quantitative PCR analysis showed that Tbx1 expression rose to a peak level at 36 hpf in wild type group. Repression of Tbx1 expression was most evident at 36 hpf, 24 hours after RA treatment. 10(-7 )mol/L RA caused a more severe effect on the Tbx1 expression level than 5 x 10(-8)mol/L RA.The results suggested that RA could produce an altered Tbx1 expression pattern in zebrafish. In addition, RA could repress Tbx1 expression in a dose-dependent manner.     

斑马鱼整体原位杂交法研究MMP15a的发育相关表达的初步观察

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶15a（MMP15a）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP15a RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP15a基因在胚胎斑马鱼的表达。结果MMP15a基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,从受精后24h起,在眼睛处表达明显,从受精后48h MMP15a在胸鳍和耳囊有特异性表达至到受精后96h。MMP15a在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在胸鳍和耳囊处有持续表达。     

整体原位杂交法初步研究MMP11b在斑马鱼胚胎发育过程中的表达

克隆斑马鱼基质金属蛋白酶11b（MMP11b）基因,并研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的时空表达状况。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎,制备DIG标记的MMP11b RNA探针,采用全胚胎原位杂交方法研究MMP11b基因在斑马鱼胚胎的表达。MMP11b基因在胚胎受精后一个细胞时期就开始表达,并且一直持续到96h,从受精后24h起,在耳囊处表达明显,在受精后48h时期在胸鳍和肛门处也有特异性表达。MMP11b在斑马鱼胚胎发育不同时期表达明显,且在耳囊处有持续表达。