不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。     

雨生红球藻FACHB-712营养细胞和厚壁孢子低温保藏效果及优化

以高产虾青素的雨生红球藻（Haematococcus pluvialis Flotow）FACHB-712藻株为材料,研究2种细胞形态（营养细胞和厚壁孢子）在低温保藏下的复苏率及其差异原因。结果显示,采用两步法（先预冻降温后再投入液氮中）冻存其营养细胞,在不同冻存条件下,其存活率均低于5%,以10%甘油作为保护剂、冻存速率为0.5℃/min、预冻温度为-40℃、保留30 min,然后再投入液氮罐（-196℃）中保藏,其存活率可达到13.3%。采用两步法冻存厚壁孢子,其复苏存活率高达66.13%,复苏萌发后细胞的生长特性、虾青素含量与液氮保藏前无明显差异（P > 0.05）。对液氮保藏前后藻细胞形态和超微结构观察结果表明,超低温保藏后,营养细胞的结构受到较大损伤,而厚壁孢子受到的损伤相对较小。当添加不同保护剂后,直接将厚壁孢子分别冻存在-20℃、-80℃低温及液氮中,发现-80℃低温冻存处理组的复苏存活率相对较高,可达27%。研究表明采用两步法先预冻降温后再投入液氮中冻存厚壁孢子,是长期保藏雨生红球藻FACHB-712的最佳方法,也可采用一步法将厚壁孢子冻存于-80℃冰箱中。     

无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存方法分析

为了制备无细胞百日咳效价测定用攻击菌并用液氮进行保存,对此方法进行评价。采用原代攻击菌复苏传代后测定细菌浓度,并用蛋白胨水稀释为27亿个菌/m l,分装冻存管中。放入液氮罐内,并对液氮保存的攻击菌进行相应的检测,用统计软件计算。结果显示,此方法制备的攻击菌与传统的攻击菌无显著性差异,冻后虽攻击菌的毒力有所下降,但都在100-1000/MLD的正常范围内,且冻后0、3、6、9、12月无显著性差异。同批支间差异小,CV<5%。通过此方法制备的攻击菌稳定性好,试验结果符合《中华人民共和国药典》要求,可用于无细胞百日咳的效价测定。     

人胚胎干细胞程序降温保存的实验研究

本文采用升降式程序降温仪对人胚胎于细胞进行了程序降温保存,并探讨和比较了降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响。结果表明:采用Me_2SO 血清 DMEM(体积比为1∶3∶6)的保护剂,从0℃开始,以0.5℃/min的速率对细胞悬液降温;至-10℃时对其进行置核,并于-35℃时将其快速投入液氮中保存,复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81.8%,复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同,且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性,同时染色体组型仍正常。     

人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能

研究人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能。应用包含10%二甲基亚砜、90%小牛血清的冻存液冻存6个T细胞系(5个CD4 T细胞系,1个CD8 T细胞系)细胞,液氮中冻存32~54个月后复苏,台盼蓝染色法检测复苏后T细胞系细胞的存活率,用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测复苏后T细胞系细胞的功能。结果显示,6个T细胞系细胞液氮冻存解冻后细胞的存活率为24.7%~93.5%,过夜培养后细胞的存活率为2.5%~72.2%。CD8 T细胞系细胞的存活率高于CD4 T细胞系细胞。6个复苏后的T细胞系细胞在PHA诱导后均能分泌IFN-γ。人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存复苏后能够保持较好的存活率和功能。     

超低温保存鸡红细胞条件的选择

通过比较液氮冻存鸡红细胞(CRBC)时,不同组成的冻存保护液及不同的降温程序,对CRBC活力的影响来选择最佳的冻存条件。结果表明,含15％二甲基亚砜(DMSO)的不添加血清RP—MI-1640培养液．具有良好保持冻存CRBC活力的作用。以样品悬置液氮罐口10min→浸入液氮的程序降温,经40℃水浴复苏,CRBC的活力高于90％。CRBC由于廉价易得,是学生人数较多时进行细胞冻存与复苏实验的优良材料。     

人胚胎干细胞程序降温保存的实验研究

本文采用升降式程序降温仪对人胚胎干细胞进行了程序降温保存,并探讨和比较了降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响。结果表明：采用Me2SO 血清 DMEM(体积比为1：3：6)的保护剂,从0℃开始,以0．5℃／min的速率对细胞悬液降温;至-10℃时对其进行置核,并于-35℃时将其快速投入液氮中保存,复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81．8％,复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同,且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性,同时染色体组型仍正常。     

实验小鼠H-2抗原单克隆抗体的效价研究

目的　研究实验小鼠H - 2抗原单克隆抗体在初建时和经冷冻保存后的效价变化规律 ,为长期保存小鼠H - 2抗原单抗及规模性推广这一遗传监测方法奠定技术基础。方法　制备 6种抗小鼠H 2抗原的单克隆抗体 ,将具备一定抗体效价 (16 0倍以上 )的细胞株保存在 - 196℃的液氮中 ,数月后将复苏后的部分细胞株培养 4 8h后 ,取其上清液用微量细胞毒试验法测定抗体的效价 ,并与其原有效价进行比较。结果　单抗初建时效价达到 16 0倍以上的细胞株占总株数的 37%～ 5 3% ,H 2K抗体复苏后效价持平的细胞株占 13% ,效价下降的为 74 % ,效价上升的是 13% ;H 2D抗体效价持平的细胞株占 5 3% ,下降的为 31% ,上升的是 16 %。复苏后的抗体效价大部分与原效价持平或略有下降 ,个别的会有所提高。结论　单克隆抗体的效价略低于同种单价特异性抗血清 ;能否使冻存后的抗体保持原有的效价是抗体能否大量生产并推广的关键 ;要长期保存和生产H 2抗原单抗 ,应加强克隆和检测工作 ,建立稳定的制备、保存和检测系统 ,才能为实验动物的遗传监测提供技术服务     

恒河猴(Macaca mulatta)肾细胞冻存复苏培养及其生物学特性的研究

本文使用深低温(-196℃)冻结保存动物细胞技术,对胰酶分散的恒河猴肾细胞的冻存,复苏培养及其生物学特性进行了研究。结果表明、液氮冻存2—58周的恒河猴肾细胞,其平均存活率为63.3—74.4％。复苏培养细胞于6—7天形成緻密单层,对脊髓灰质炎病毒敏感;国产二甲基亚砜可以用作冻存细胞的保护剂;复苏培养的细胞核型正常;其生物学特性与未冻的原代细胞一致。     

乙型肝炎病毒表面抗原a、d、r亚型单克隆抗体的制备与应用

本文成功地建立了分泌抗乙型肝炎病毒表面抗原(抗-HBsAg)a,d、r3种亚型决定簇抗体的4株杂交瘤细胞。经一系列生化、免疫学鉴定,证明4株细胞所分泌的单克隆抗体(McAb)均具有各自的亚型特异性。反复克隆培养16周,并液氮冻存8个月后复苏,抗体的效价仍稳定不变。用纯化的McAb制备RPHA诊断试剂,检测了80例有乙型肝炎自觉症     

介绍一种少量冻存细胞复苏技术

液氮冻存后复苏细胞活力有所下降,有不少死亡细胞。特别是在冻存细胞数量较少时,如在单克隆抗体制备过程中为防止传代污染或变异而丢失杂交瘤细胞,随时冻存的少量细胞,复苏效果往往并不理想。除了加入饲养细胞有利于细胞生长等措施外,我们将常规的复苏技术加以改进。     

活体肺癌组织玻璃化保存的研究

保存活体的肺癌组织将为肺癌发病基因筛查和靶向药物筛选等体外实验研究提供更完整的样本信息. 本文对活体肺癌组织的玻璃化保存方法进行研究，首先采用针浸法玻璃化保存单块肺癌组织，对所需低温保护剂的浓度和平衡时间进行了优化；其次采用冻存管对多块肺癌组织样本进行玻璃化保存，对低温保护剂溶液体积以及平衡时间进行了优化；最后对慢速冷冻、不加低温保护剂快速冷冻、玻璃化冷冻3种冷冻方法的冻存效果进行比较并通过低温显微分析其冰晶损伤机理.结果表明，20% EG+20% DMSO+0.5 mol/L海藻糖作为低温保护剂，在平衡溶液和玻璃化溶液分别加载3 min和1 min时，针浸法和0.25 ml冻存管内玻璃化冻存，复苏后组织活力最高，分别约为79.96%与80.44%. 免疫组化显示玻璃化保存肺癌组织经过复苏后，相比慢速冷冻和无保护剂快速冷冻，组织结构损伤较小，组织内细胞TUNEL阳性表达较少. 低温显微结果表明，玻璃化保存组织内部及周围只出现少量细小冰晶，而慢速冷冻、快速冷冻组织皆出现明显冰晶.     

胚脑神经元冻存和培养的研究进展

影响胚脑神经元冻存效果的关键因素有:冷冻保护剂及其浓度、降温和复温速率、储存温度等。以10％DMSO作为冷冻保护剂,以接近1—2℃/分的速率降温,37℃水浴中快速复苏,储存在液氮中,能较好的保证冻存神经元的存活率。冻存的胚脑神经元,培养后继续存活的细胞数比未经冻存的明显减少,但生长、分化情况却无显著差别,仍保持了神经元的形态学特征和特异性酶的表达及递质合成的功能,并能在宿主脑内继续生长、发育、发生整合。     

兔脂肪组织来源干细胞的分离培养及冻存复苏初步研究

目的:体外分离培养兔脂肪组织来源干细胞,初步探索其冻存复苏条件,为声带损伤修复重建的实验研究奠定基础.方法:分离兔腹股沟脂肪组织,胶原酶消化,低糖DMEM培养,倒置显微镜下观察其形态,MTT法检测其生长规律,定向诱导方法检测细胞的多向分化潜能,并进行冻存复苏.结果:分离培养的细胞具有很强的增殖能力和多向分化能力,在特定条件下可分化为脂肪细胞和成骨细胞,冻存复苏后的细胞仍能保持冻存前的生物特性.结论:成功分离培养出兔脂肪组织来源干细胞,其在液氮中能长期冻存且能复苏存活,可用于修复损伤的兔声带的实验研究.     

谷胱甘肽与富氢冻存液在鸡血细胞冻存中的保护作用

目的通过观察细胞冷冻复苏后的存活率及凋亡情况,探讨细胞冻存液中添加谷胱甘肽(GSH)和氢气(H_2)对细胞的保护作用。方法在冻存液中添加GSH和/或通入H_2后冻存鸡血细胞,1个月后复苏,采用台盼蓝拒染和MTT法分别检测细胞存活率与细胞活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果 GSH、H_2或H_2+GSH处理使细胞活力明显提高,而早期凋亡率明显降低。结论谷胱甘肽与富氢冻存液对鸡血细胞冻存具有保护作用。     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

利用低温冰箱进行细胞长期保存的研究

利用 -70℃低温冰箱成功进行了对细胞的长期保存 ,在保存长达 8个月的时间内 ,复苏的细胞 ,与液氮保存的细胞复苏效果相同。该方法是液氮保存外的一种简便、可行、低成本方法     

胰岛冷冻保存方法研究进展

本文就目前国内外所研究的胰岛及胰腺组织碎片冷冻保存方法进行了总结,认为胰岛冻存前可进行24小时培养或不培养;抗冻剂DMSO浓度以10％(1.5mol/L)为佳;4℃或0℃平衡30分钟;缓慢降温至-70℃,投入液氮;快速复温(200℃/分)后冰浴中倍比稀释透出DMSO为较理想的冻存和复苏模式。该模式可以最小限度地降低胰岛的损伤,提高胰岛存活率及保持较高的胰岛素分泌功能。     

利用低温水箱进行细胞长期保存的研究

利用-70℃低温冰箱成功进行了对细胞的长期保存,在保存长达8个月的时间内,复苏的细胞,与液氮保存的细胞复苏效果相同,该方法是液氮保存外的一种简便,可行、低成本方法。     

低浓度二甲基亚砜保护SSMC7721细胞冻存后活力

目的研究二甲基亚砜作为冻存保护剂对SSMC7721细胞冻存复苏后细胞生长相对活力和凋亡的影响。方法选择传代培养处于对数生长期SSMC7721细胞,体积分数2%、5%、10%和20%DMSO分别冻存10d、30d后复苏,采用倒置显微镜形态学观察、MTT法测定细胞相对活力、流式细胞仪检测细胞凋亡,综合分析不同浓度DMSO冻存不同时间复苏对SSMC7721的影响。结果各浓度DMSO冻存SSMC7721对细胞生长和凋亡均有影响。20%DMSO对SSMC7721细胞影响明显,细胞培养不易贴壁逐渐脱落,浓度低于5%时,细胞生长状态良好;10%和20%DMSO细胞相对活力急剧下降;随着DMSO浓度增加和冻存时间延长,细胞凋亡率明显上升,存活率明显下降,5%DMSO冻存的凋亡率10.24%,20%DMSO冻存的凋亡率93.49%。结论 2%~5%DMSO冻存肝癌SSMC7721细胞,复苏后培养有较好的细胞相对活力,能有效减少细胞凋亡,起到的冻存保护剂作用。