人胚胎干细胞程序降温保存的实验研究

本文采用升降式程序降温仪对人胚胎干细胞进行了程序降温保存,并探讨和比较了降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响。结果表明：采用Me2SO 血清 DMEM(体积比为1：3：6)的保护剂,从0℃开始,以0．5℃／min的速率对细胞悬液降温;至-10℃时对其进行置核,并于-35℃时将其快速投入液氮中保存,复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81．8％,复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同,且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性,同时染色体组型仍正常。     

雨生红球藻FACHB-712营养细胞和厚壁孢子低温保藏效果及优化

以高产虾青素的雨生红球藻（Haematococcus pluvialis Flotow）FACHB-712藻株为材料,研究2种细胞形态（营养细胞和厚壁孢子）在低温保藏下的复苏率及其差异原因。结果显示,采用两步法（先预冻降温后再投入液氮中）冻存其营养细胞,在不同冻存条件下,其存活率均低于5%,以10%甘油作为保护剂、冻存速率为0.5℃/min、预冻温度为-40℃、保留30 min,然后再投入液氮罐（-196℃）中保藏,其存活率可达到13.3%。采用两步法冻存厚壁孢子,其复苏存活率高达66.13%,复苏萌发后细胞的生长特性、虾青素含量与液氮保藏前无明显差异（P > 0.05）。对液氮保藏前后藻细胞形态和超微结构观察结果表明,超低温保藏后,营养细胞的结构受到较大损伤,而厚壁孢子受到的损伤相对较小。当添加不同保护剂后,直接将厚壁孢子分别冻存在-20℃、-80℃低温及液氮中,发现-80℃低温冻存处理组的复苏存活率相对较高,可达27%。研究表明采用两步法先预冻降温后再投入液氮中冻存厚壁孢子,是长期保藏雨生红球藻FACHB-712的最佳方法,也可采用一步法将厚壁孢子冻存于-80℃冰箱中。     

胚脑神经元冻存和培养的研究进展

影响胚脑神经元冻存效果的关键因素有:冷冻保护剂及其浓度、降温和复温速率、储存温度等。以10％DMSO作为冷冻保护剂,以接近1—2℃/分的速率降温,37℃水浴中快速复苏,储存在液氮中,能较好的保证冻存神经元的存活率。冻存的胚脑神经元,培养后继续存活的细胞数比未经冻存的明显减少,但生长、分化情况却无显著差别,仍保持了神经元的形态学特征和特异性酶的表达及递质合成的功能,并能在宿主脑内继续生长、发育、发生整合。     

BALB/C小鼠杂交瘤细胞冻存初探

自从Polge(1949)用甘油作为保护剂成功的冻存了Hela和L细胞以来,细胞冻存技术已日趋完善。本文对细胞株的冻存分别采用-70℃冰箱和常用的液氮深低温的方法。定期复苏,测定抗体效价,最后作染色体比较,至今已一年多,其结果令人满意。现将结果简要报告如下。方法1.细胞冻存:选择生长旺盛期,形态良好的细胞,按每ml细胞冻存液内含活细胞约1×106个,每支冻存管1ml。细胞冻存管置-20℃冰箱内15小时左右,分别放入液氮和-70℃冰箱内。经不同时期后取出作复苏及抗体效价比较。2.细胞复苏:取出冻存管,迅速浸入37℃水浴中,在1分钟内解冻后转种到已预制…     

小鼠睾丸组织慢速冷冻保存工艺的优化研究

目的 冷冻保存睾丸组织用于后期移植,是除精子冻存以外保持男性生育力的另一有效途径。本文对块状睾丸组织常用的慢速冷冻降温程序进行了改进。方法 通过缩短保护剂加载时间、提高第一阶段的冷却速率、第二阶段直接投入液氮等方法对小鼠睾丸组织进行冷冻保存。在不同温度对小鼠睾丸组织冻存体系进行诱导冰晶成核并冻存,降低睾丸组织慢速冷冻保存所需保护剂浓度。结果 改进的两步法冻后组织内生殖细胞的凋亡阴性率均较高,其中精原细胞98.4%、精母细胞99.2%、精子细胞88.4%、支持细胞98.1%,显著高于常用慢速冷冻组,与对照组均无显著性差异。相比于未置核组, -10℃置核可显著提高5% DMSO保护剂慢速冷冻保存的冻后效果,生殖细胞的凋亡阴性率为精原细胞82.9%、精子细胞92.1%、精母细胞93.2%及支持细胞88.9%,与较高浓度保护剂10% DMSO组冻存结果无显著性差异,说明置核能够降低所需保护剂的浓度,降低毒性损伤。结论 本研究通过改进两步法和置核提高了小鼠睾丸组织冻后的质量,为临床上人睾丸组织的冻存提供参考。     

恒河猴(Macaca mulatta)肾细胞冻存复苏培养及其生物学特性的研究

本文使用深低温(-196℃)冻结保存动物细胞技术,对胰酶分散的恒河猴肾细胞的冻存,复苏培养及其生物学特性进行了研究。结果表明、液氮冻存2—58周的恒河猴肾细胞,其平均存活率为63.3—74.4％。复苏培养细胞于6—7天形成緻密单层,对脊髓灰质炎病毒敏感;国产二甲基亚砜可以用作冻存细胞的保护剂;复苏培养的细胞核型正常;其生物学特性与未冻的原代细胞一致。     

冷冻保存大鼠胎脑的体外培养活性观察

大鼠胚胎大脑组织用1mol/L二甲基亚砜(DMSO)作为保护剂,以1℃/分的速率冷冻,至-70℃,在液氮中保存60天后在37℃水浴中快速复温并去除保护剂,然后进行体外培养。结果表明,冻-融后的胎脑组织在55天的体外培养过程中,神经元及其他非神经元细胞逐渐生长分化成熟,具有正常的细胞形态;美兰活体染色、甲酚紫染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)染色结果显示,组织中各种细胞的形态和染色反应正常,神经细胞有发达的尼氏体,胆硷能神经元也分化成熟;放射自显影结果显示,培养的组织中50％以上的神经元有高亲和性摄取GABA的功能。这些结果说明,胚胎大脑组织在冻存后其活性在很大程度上能得以维持。     

胰岛冷冻保存方法研究进展

本文就目前国内外所研究的胰岛及胰腺组织碎片冷冻保存方法进行了总结,认为胰岛冻存前可进行24小时培养或不培养;抗冻剂DMSO浓度以10％(1.5mol/L)为佳;4℃或0℃平衡30分钟;缓慢降温至-70℃,投入液氮;快速复温(200℃/分)后冰浴中倍比稀释透出DMSO为较理想的冻存和复苏模式。该模式可以最小限度地降低胰岛的损伤,提高胰岛存活率及保持较高的胰岛素分泌功能。     

外周血造血干细胞不同保存方法的比较

目的为造血干细胞低温保存选择合适的方法.方法20例外周血单个核细胞加入DMSP或DMSO加HES,-80℃冰箱(简称冰箱)或程控降温,冰箱或液氮保存,定期检测标本的CFU-GM,LTC-CD34 ,TBR,计回收率.结果冰箱降温并保存,5%DMSO-6%HES为保护剂的CFU-GM、LTC-IC、CD34 、TBR回收率分别为82.2%±14.7%、83.0%±12.2%、94.2%±4.3%、97.7%±3.9%,比10%DMSO者具体回收率明显高(P＜0.05);同一种保护剂下冰箱降温并保存与程序降温冰箱保存比,差异不显著(P＞0.05),冰箱降温并保存、冰箱降温液氮保存及程控降温液氮保存,在一年内,各种回收率差异不显著(P＞0.05),二年时,只有冰箱降温并保存者其各种回收率指标明显下降(P＜0.05);细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,室温下放置,细胞活力的各指标均下降(P＜0.05),以含10%DMSO为保护剂者影响最大.结论造血干细胞优选保存方法是保护剂用5%DMSO-6%HES,保存时间不超过一年时,用冰箱降温并保存,长期保存时,冰箱降温则需液氮保存,细胞复温后,标本内保护剂应立即稀释(临床应用)或去除.     

DMSO浓度及降温速率对组织工程化真皮超低温保存效果的影响

组织工程化真皮的超低温保存技术是皮肤组织工程的重要组成部分,对皮肤组织库的建立有重要意义。低温保存与低温保护剂的种类、浓度、降温复温程序及低温保护剂的添加与去除方式有着密切的关系。实验目的：研究DMSO浓度及降温速率对组织工程化真皮超低温保存效果的影响。实验方法：以培养一定时间的组织工程化真皮为试材,以不同浓度的DMSO溶液为低温保护液,以不同的降温速率降温保存,以四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,辅以光学显微镜和扫描电镜观察分析。实验表明：降温速率为1℃／min,DMSO浓度为1．4mol／L时可获得在实验范围内较高的细胞存活率,为75％,超低温保存后的扫描电镜照片表明其细胞形态最为接近新鲜状态,细胞与支架材料的黏附也很紧密,这与细胞存活率的研究结果有很好的相关性。