酶分子设计常用策略和进展

酶分子的生物学功能很大程度上是由其三维空间结构和所处溶剂环境共同决定的。因此,优化酶分子的结构性质以及探索其性质最优的溶剂环境是改善酶分子功能以及进行理性设计的一个可行途径。从实际应用的角度来看,分子设计方法可以为酶工程提供一种有效的解决方案。目前,酶分子设计有两个重要的研究方向,包括提高酶分子的催化活力和优化其稳定性。同时,对酶分子设计方法的研究也有助于对蛋白质生物学机理的探索。在近些年的学术界酶分子设计案例中,生物信息学方法得到广泛的应用。本文系统地总结基于生物信息学的酶分子设计方法的背景、策略和一些经典案例。     

N-氨甲酰基-D-苯甘氨酸不对称热水解反应的研究

D－苯甘氨酸是半合成β－内酰胺类抗生素的重要原料,它的合成主要是从5－苯基海因出发,经海因酶开环生成N－氨甲酰基－D－苯甘氨酸后,再脱去氨甲酰基得到。后一步目前国内外主要用两种方法：一种是用亚硝酸通过迭氮化反应脱氨甲酰基^[1],另一种是用酶法脱氨甲酰基⑵。但这两种方法都存在一定问题。亚硝酸是致癌物质．会带来环境污染。酶法则由于微生物天然存在的脱氨甲酰基酶活力只有海因酶的1％～2％⑵,反应效率很低。因此,N－氨甲酰基－D一苯甘氨酸脱氨甲酰基反应就成为D－苯甘氨酸合成路线中的一个瓶颈。最近．我们发现在弱酸或弱碱条件下,N－氨甲酰基－D－苯甘氨酸加热可以得到D－苯甘氨酸,可望解决这一瓶颈问题。本文报道了对该反应的部分研究结果。     

白腐真菌Trametes sp. SQ01漆酶的新功能:转化2-羟基-6氧-6-苯基-2,4-己二烯酸

【目的】利用白腐真菌Trametes sp.SQ01漆酶转化2-羟基-6氧-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDAs),可以帮助我们进一步了解漆酶新的催化特性及解决多氯联苯降解过程中HOPDAs的积累问题。【方法】利用紫外可见光谱分析法,研究了漆酶对8种不同取代基的HOPDAs的转化情况,并对漆酶的稳态动力学参数进行了测定。【结果】漆酶可以在没有任何中介物的条件下催化HOPDAs,并生成无色的物质,尤其是漆酶可以催化3,8,11-3Cl HOPDA,而这一物质几乎不能被BphD和Rhodococcus sp.R04转化。稳态动力学分析表明,在5种HOPDAs中,10-Cl HOPDA是漆酶的最适底物,其Km与HOPDA和8-Cl HOPDA相近。尽管3,10-2F HOPDA并不是漆酶的最适底物(Km=17.02μmol/L),但是它的转化效率(kcat/Km)是最高的。【结论】漆酶可以有效转化多种HOPDAs,这为多氯联苯的降解提供一种新的思路。     

分子模拟在门冬酰胺酶Ⅱ表面呈现多肽技术中的应用

简要地介绍了表面呈现技术和组合酶技术的应用以及发展前景,描述了一种应用分子建模系统辅助进行抗动脉粥样硬化的嵌合酶疫苗的构建过程。门冬酰胺酶活力测定结果证明,嵌合酶的空间结构和活性位点均能够依照设计要求保留。提供了一种生物信息学手段在组合生物合成领域中的应用方法。     

经过改造的酶可以提高油和脂的质量

美国Genencor公司的蛋白质工程专家最近改进了一种酶,这种改进了的酶可以把廉价的植物油转变为优质产品。例如,某种稳定有效的酶可以把便宜的棕榈油转变成贵重的可可脂。通过改变组成甘油三酯的脂肪酸的比例类型而制造的产品可以取代其它许多高价的植物油和动物脂。 Genencor的研究人员正在研究的是枯草杆菌蛋白酶,这是人们所熟悉的一种用于洗涤剂中清除蛋白污渍的酶。早些时候,Genencor曾通过置换该酶分子链上一或两个关键位置的一个氨基酸而改进了它的功能。此外,枯草杆菌蛋白酶属于丝氨酸水解酶,这类酶中有一     

DNA-蛋白质相互作用的研究——EcoRI内切酶切割P_2-DNA

限制性核酸内切酶不仅是分析和操纵DNA序列的工具,而且也为研究DNA-蛋白质之间相互作用提供了一条可行的途径。核酸内切酶如何识别、结合、切割DNA,不少文章已有报道。至今没有解决的一个问题是:同一DNA分子上具有相同核苷酸顺序的不同限制位,为什么能以不同的速度为同一种内切酶切割。为了研究这个问题,我们选择P_2噬菌体DNA和EcoRI内切酶作为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法研究其切割机制,所得资料表明,不同限制位点的切割速度     

“二合一"酶：柔性更强

“二合一"酶：柔性更强 德国波鸿-鲁尔大学的科学家近日解决了一种柔性很强酶的结构问题,明确了其空间构象,该酶通常存在于一种感染海洋细菌的病毒体内．这种感染海洋蓝藻纲原绿球藻的病毒与其宿主相比,能更有效地产生一种色素．要产生这种色素,原绿球藻需要两种酶,而病毒仅需要一种酶——一种“二合一”的酶．Thorben Dammeyer 是Nicole Frenkenberg-Dinkel教授 (微生物生理学)和Eeckhard Hofmann副教授(蛋白X-射线衍射分析)共同领导的研究小组的成员,作为他研究论文的一部分,解决了这种酶的三维结构问题,发现这种酶的柔性很强,蛋白的某些部分所处的空间位置可以发生变化,这在酶与其底物同时存在的情况下是一种很罕见的现象．他们的研究结果发表于近期的Journal of Biological Chemistry上,并被评为“Paper of the Week”．这种含有“二合一”酶的病毒叫做P-MMS2,通常感染蓝藻纲原绿球藻,在世界海洋中大量存在．与蓝细菌不同,这种病毒不利用红蓝色素进行光合作用,而是像高等植物那样利用叶绿素．原绿球藻本身也能生产各种色素,但需要两步反应,两种酶催化．Nicole Frenkenberg-Dinkel说“我们在病毒中发现了一种酶的基因信息,这种酶使得病毒比其宿主能更有效的产生红色素（只需要一步反应）．这让我们相信,尽管光捕获时并不需要,但红色素对原绿球藻很重要．同时,我们更想知道什么原因使得这种酶能整合两种酶的功能．”科学家利用X 射线衍射从原子水平分析了这种酶在自然状态以及与天然底物共同存在时的三维结构．他们发现,酶的天然底物胆绿素IXa存在于酶的“结合口袋”部位,在这里变成红色素．Frenkenberg-Dinkel教授解释,科学家们可以清楚地看到酶的“结合口袋”周围的部分所处的位置可以发生变化而形成不同的构象,这对于处于液相中的蛋白可能很常见,但处于晶体状态的蛋白则是极为罕见的．这种结构转变让科学家们第一次认识到了处于催化过程中的酶的运动变化情况．更进一步的研究包括利用靶向或随机改变这种高柔性酶的基因结构,观察这种特殊的酶的体外进化情况． （张晨光摘译自Science Daily, October 6,2008, 杜丽校）     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,ADNABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了ADNABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL-7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,AD-NABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了AD-NABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

基于肌红蛋白的氧激活蛋白的理性设计

金属酶催化了生命活动及工业催化中的很多重要反应。天然金属酶的研究往往受限于蛋白质本身结构复杂、表达纯化困难等问题。通过理性设计,可以在分子量小、结构简单、易于表达的骨架蛋白中模拟天然金属酶的结构、光谱和功能,构建人工金属酶。人工酶可以为天然酶的机制研究提供新的平台。本文中,笔者探讨以肌红蛋白为骨架蛋白,通过结构特征的模拟、非天然氨基酸的引入等手段,模拟氧激活蛋白,尤其是氧化酶。综述以对理性设计得到的人工氧化酶的反应中间体进行研究的进展,发现金属酶活性中心的酪氨酸作为催化反应的关键残基,对于氧化反应的调控非常重要;而在小分子量骨架蛋白中模拟天然金属酶是一种人工金属酶分子设计的方法,可以用于研究血红素酶外的其他金属酶。     

一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。     

CELⅠ酶的粗提取及其活性检测

CEL I酶是第一个从真核生物中提取的用于高效特异切割DNA双链碱基错配和DNA扭曲的内切酶, 因而也是TILLING技术中用到的一种关键酶。文章对CELI酶的粗提取及其活性检测进行了研究。错配切割实验表明, CELI酶在包含有G→A点突变的杂合双链中, 能有效地在错配位点进行切割, 并可以通过ABI377测序仪获得直观的检测结果, 从而可以用于TILLING分析。     

纤维素酶活力的计算方程

因为纤维素酶的底物纤维素是不溶解的,通常所谓的纤维素酶活力都是在底物不饱和的情况下测定的,因此,测得的酶活力总是偏低的。底物浓度一定,使用的酶浓度越大,底物不饱和程度也越大,测得的酶活力也就越低。因此,不同来源的酶制剂的活力很难进行比较。为了解决这一问题,本文推导了一个外推酶活力计算方程。外推酶活力可以完全消除底物不饱和程度对酶活力测定造成的干扰,用于不同酶制剂的活力比较,是一个较理想的指标。但是,外推酶活力仅仅是一个理论值,其推算要以较多的实验数据为基础。为了简便,当作大量对比试验时,还是要用直接测定的数据表示酶活力。不过,这时必需对所测的数据作某些校正。校正后的数据虽未完全消除底物饱和程度不同造成的干扰,却可使各数据受到的干扰程度相同。为此,本文还提供了一种酶活力校正曲线。     

心脏和软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定

我们曾经报道了分别在心脏(α—MHC—Cre)和软骨细胞(Col2A1-Cre)特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的成功研制。为了对这2种转基因小鼠进行特异性的基因型鉴定,设计了2对特异性PCR引物,其中一条引物分别位于α-肌球蛋白重链基因(α-MHC)启动子和Ⅱ型胶原(Col2Al)启动子上。以6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA为模板,利用设计的特异性引物以及位于Cre编码区的通用引物进行PCR反应。结果显示,2对特异性引物可以分别将心肌细胞特异性和软骨细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠与其他组织特异性Cre重组酶转基因小鼠有效区分开来。     

Ⅱ型限制性核酸内切酶的性质

限制性核酸内切酶(以下简称限制酶)是一类水解DNA的磷酸二酯酶。因为它能识别特定的碱基序列并能在特异位点切割DNA,在分子生物学、遗传工程等研究中已成为一种极有用的工具酶,并为研究蛋白质与核酸的相互作用提供了一个理想的模型。限制酶是在研究噬菌体与寄主相互关系这个问题时发现的。Meselson等人在1968年从大肠杆菌K_(12)中分离到第一个限制酶。从1968年至今,已发现了近500种限制酶,具有103种不同的专一性。     

一种棉花线粒体DNA的提取方法

线粒体是重要的细胞器,它有自身的基因组。其基因组DNA与细胞核基因组DNA相比,含量较低。棉花当中富含棉酚、丹宁等物质,这对提取DNA有很大的影响。因此我们根据棉花自身的特点,找到了一种提取棉花线粒体DNA经济有效的方法,其质量可以满足限制性酶切、PCR、分子杂交等实验的要求。     

意大利科学家成功地克隆一种人体酶

意大利一个由四位科学家组成的小组(属遗传和生物物理国际研究所,意大利Napies,小组负责人L,Luzzatto,45岁)成功地将一种人体酶克隆。上周意大利国家研究委员会这样说,这是在历史上第一次使这种酶产生一种精确的复制品。该组研究者D.Toniolo在一次电话上说:“我们仅克隆了一个分子的很小一部分”。复制的分子DNA     

融合酶构建技术在酶的改性以及多功能酶的构建方面的应用

融合酶技术是酶的改造技术之一。应用融合酶技术还可以创造出多功能的新酶,这些新酶有望应用于食品、化工等领域。目前研究表明,融合酶在低聚糖制备,生物燃料,生物材料,氨基酸发酵以及生物传感器等领域极具应用前景。融合酶的构建技术有理性设计和非理性设计,这两种技术各有利弊。整理了近年融合酶在以上领域中的研究成果,对融合酶的工业应用进行讨论。     

意大利科学家成功地克隆一种人体酶

意大利一个由四位科学家组成的小组(属遗传和生物物理国际研究所,意大利Napies,小组负责人L,Luzzatto,45岁)成功地将一种人体酶克隆。上周意大利国家研究委员会这样说,这是在历史上第一次使这种酶产生一种精确的复制品。该组研究者D.Toniolo在一次电话上说:“我们仅克隆了一个分子的很小一部分”。复制的分子DNA     

人胰岛素基因的合成Ⅷ.表达型质粒的构建和在大肠杆菌内生产含胰岛素原的融合蛋白

我们已构建两组质粒,适合于在大肠杆菌内克隆基因和直接大量咸融合蛋白。这些质粒含有E.coli的lac启动基因和部分编码β-半乳糖苷酶的序列,编厔的蛋白长度约590或450个氨基酸殖基(原基因编码1023个氨基酸殖基)。被缩短的β-半乳糖苷酶基因的末端跟随一个多种限制性酶的接头序列;这个序列可被八种限制性酶中的任一种切断,然后插入任何蛋白基因。每组质粒有三种,可以满足所有三种不同的翻译读框。我们克隆了人工合成的入胰岛素原基因到这些质粒上去,在大肠杜菌内可以生产大量β-半乳糖苷酶残基—人胰岛素原融合蛋白。