家蚕脂肪体蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕末龄幼虫的脂肪体组织进行了研究,采用基质辅助质量飞行时间质谱对其中一些表达量较高的蛋白点进行了鉴定,并利用GPMAW软件结合家蚕基因组预测的蛋白质数据库构建了本地的肽质量指纹图谱数据库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。研究发现,经过双向凝胶电泳及其图象分析技术,银染可以分离出722个清晰蛋白点,这些蛋白质主要集中在分子量15～90kD区域,等电点pH4～8之间。MALDI-TOF-MS鉴定的41个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中34个蛋白点得到了成功鉴定,其中包括了大量参与代谢的酶类、不同分子量的热激蛋白、重要的血液蛋白30K,Actin3等,这一结果对人们进一步认识家蚕脂肪体提供了有利的帮助。     

家蚕丝腺蛋白质组学研究方法的建立

通过高精度的双向电泳技术对家蚕中部丝腺组织的蛋白质进行分离,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)对其中一些表达量较高的蛋白点进行鉴定,并利用GPMAW(GeneralProtein/MassAnalysisforWindows)软件结合家蚕基因组预测的蛋白质数据库构建本地的肽质量指纹图谱数据库,对所得到的肽质量指纹图谱进行分析。研究发现,经过双向凝胶电泳及其图象分析技术,硝酸银染色和考马斯亮蓝染色分别能分离出500个以上和100个以上的蛋白点。这些蛋白质点主要集中在分子量15~90kD区域,等电点pH3·5~7之间。MALDI-TOF-MS鉴定的25个考染蛋白点中有60%以上的PMF(PeptideMassFingerprint)的信号峰较强。在数据库检索过程中,利用家蚕肽质量指纹数据库所得检索结果与在Mascot的检索结果相比,前者不仅能够准确鉴定出一些已有研究报道的蛋白,从而验证检索方法的可行性,而且还能够对一些已经被家蚕基因组数据库所预测但未曾报道的新蛋白质进行鉴定,从而建立了一整套适合于家蚕蛋白质组研究的方法,并为其它绢丝昆虫蛋白质组研究提供了重要参考。     

家蚕精巢蛋白质的双向电泳及质谱分析

精巢是雄性家蚕Bombyx mori的生殖腺,它的主要功能是产生精子,全面检测和鉴定精巢器官的蛋白分布将为分析家蚕雄性个体的发育和繁殖奠定基础。本研究利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白硝酸银染色技术对家蚕5龄第5天幼虫的精巢组织进行了蛋白检测,利用基质辅助激光解析质量飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱鉴定。结果表明：家蚕精巢蛋白质可以检测出1 000个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量为15～90 kD区域,等电点3.5～9之间,其中60个蛋白点得到了成功鉴定,按照已知或推测的蛋白功能,将其分为8类,包括：细胞骨架和细胞结构蛋白,膜蛋白或信号相关蛋白,大量应激反应蛋白（伴侣蛋白）,线粒体和能量产生相关蛋白,转录调控和翻译及DNA/RNA结合相关蛋白,酶和少量血液组成蛋白。其中很多蛋白可能在鞭毛形成、能量代谢及减数分裂过程中有重要作用。这些结果为进一步认识家蚕精子形成过程提供了重要的生物学信息。     

家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9的鉴定与表达分析

羧酸酯酶是一个多功能超家族酶类, 为研究羧酸酯酶基因在家蚕Bombyx mori组织中的功能, 利用5′/3′RACE和RT-PCR方法克隆了一个家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-9, 其GenBank登录号为EU523534。该基因含有一个1 680 bp的ORF, 编码559个氨基酸。BmCarE-9预测的分子量64.2 kD, 等电点7.13, 结构分析表明BmCarE-9存在一个类似的催化三联体, 其中两个残基发生改变。利用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在家蚕5龄第3天幼虫不同组织以及在5龄期各日龄幼虫丝腺组织中的表达水平。结果表明, 该基因在丝腺中特异性高表达, 且主要在中部和后部丝腺中表达。该基因在5龄期随着丝腺的生长发育表达量逐渐增高, 到末期表达水平逐渐降低。据此推测该基因可能与丝腺的生长发育或丝蛋白的合成相关。     

中国野蚕一种强抗病毒蛋白的基因分析和活性鉴定

以最近报道的家蚕抗病毒蛋白基因为线索,从中国野蚕（Bombyx mandarina Moore）中肠内克隆了抗家蚕BmNPV病毒的SP-2 cDNA（GenBank登录号：AY945210）,基因大小855bp,编码284个氨基酸的蛋白质,分子量29．6kD,基因组全长1376bp,包含5个外显子和4个内含子．该基因的表达仅限于中肠,具有组织特异性,在幼虫龄中表达水平较高,而在眠期和熟蚕没有表达．推导其氨基酸序列,发现其C端氨基酸序列与已报道的家蚕相应序列差别较大,有8个氨基酸完全不同．通过体外重组技术,由高效基因表达系统获得大量重组蛋白,发现该蛋白具有很强的抗家蚕BmNPV活性,与家蚕对应的抗病毒蛋白BmSP-2相比,其抗BmNPV活性高1．6倍．初步认为,该蛋白质C端序列差异可能是造成家蚕与野蚕抗病毒活性差别的主要原因．     

家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析

家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳 (two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间 (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDI-TOF) 质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。     

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF-7细胞总蛋白的提取效率.MCF-7细胞经培养后,分别采用M-PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF-7细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M-PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15~70kD,pH4.7~6.3的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M-PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF-7细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.     

家蚕体液低分子蛋白Apolipophorin Ⅲ的质谱鉴定及表达分析

利用SDS-PAGE电泳对家蚕不同时期的血淋巴蛋白进行了研究。发现在家蚕羽化前,血淋巴液中有一个分子量约20kD的蛋白表达量明显上调。为了探究该蛋白的功能,本研究通过双向电泳分离和肽质量指纹图谱分析对该蛋白进行了鉴定。结果表明,此羽化前后高表达的蛋白为Apolipophorin Ⅲ蛋白,该类蛋白被普遍认为与昆虫的飞行能力有关。利用RT-PCR对该蛋白编码的基因进行了组织表达分析,结果表明该基因除了在马氏管几乎不表达外,其它组织均有表达,这也暗示了该蛋白除了与昆虫的飞行活动有关以外,还参与了幼虫及蛹期的其他重要的生命活动。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

家蚕Wnt信号通路下游关键基因Pangolin转录剪接体X3的克隆和分析

【目的】克隆家蚕Bombyx mori Wnt信号通路下游关键基因Pangolin isoforms A/H/I/S转录剪接体X3 (Pangolin X3),分析其序列和表达特征。【方法】从NCBI数据库检索家蚕Pangolin X3,根据其编码序列(coding sequence, CDS)设计引物,利用PCR从家蚕幼虫中肠和血淋巴中进行克隆并测序验证。利用SilkDB 3.0, SMART, 多序列比对和系统发育树分析Pangolin X3的序列特征。利用qRT-PCR分析Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫不同组织(头、血淋巴、体壁、性腺、中肠、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管)中的相对表达水平。【结果】从家蚕幼虫中肠和血淋巴克隆了Pangolin X3(GenBank登录号: XM_038020921)的CDS,其开放阅读框长1 560 bp,编码519个氨基酸残基,预测分子量为55.86 kD,预测等电点为7.53。Pangolin X3蛋白含有保守的β catenin结合位点和HMG结构域,其氨基酸序列在不同的昆虫中比较保守,特别是与DNA结合的HMG结构域,而与β-catenin结合的N末端CTNNB1结构域部分氨基酸残基发生变异。组织表达谱显示,Pangolin X3在家蚕5龄第3 天幼虫中肠、血淋巴和性腺中的相对表达水平较高,在头、体壁、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、脂肪体和马氏管中的相对表达水平较低。【结论】本研究克隆了家蚕Pangolin X3,分析了其序列和表达特征,为深入研究家蚕Pangolin的生物学功能提供了基础。     

造血器官机能障碍后家蚕血淋巴中蛋白质成分的变化

为了研究家蚕Bombyx mori造血器官机能障碍后其血淋巴中蛋白质成分的变化,利用重离子射线局部照射家蚕幼虫的造血器官,检测了照射后家蚕血淋巴中的蛋白质成分及注射大肠杆菌后在体内诱导出现的应急蛋白量的变化。结果表明,照射蚕血淋巴中的蛋白质含量与对照蚕之间没有明显的差异。但在成分分析时发现,5龄起蚕血淋巴中70 kD附近的3条蛋白质谱带比对照蚕的浓度要高,随着个体的发育两者的浓度都上升;5龄后期则相反,对照蚕的浓度比照射蚕高;脂肪体中贮藏蛋白质的含量具有相似的变化趋势。用家蚕贮藏蛋白质SP-1及SP-2的抗血清进行免疫印迹反应的结果显示：70 kD附近的3条蛋白质谱带的最上面的一条为贮藏蛋白质SP-1,下面的二条为贮藏蛋白质SP-2;同时照射蚕血淋巴中分子量约为24 kD的蛋白质成分也发生变化,5龄前期的浓度比对照蚕低,5龄第3天几乎检测不到;全体照射与造血器官局部照射蚕之间的结果相似。照射蚕注射大肠杆菌后在体内诱导出现的应急蛋白量明显比对照蚕要少。由此认为家蚕幼虫造血器官与血淋巴中的蛋白质成分有关,造血器官的机能障碍、血球的数量减少可影响脂肪体中蛋白质的合成,从而使存在于血淋巴中的蛋白质成分发生变化。     

Digestive enzymes during development of Ceratitis capitata (Diptera:Tephritidae) and effects of SBTI on its digestive serine proteinase targets

The digestive system of Ceratitis capitata was characterized during its larval development and in the insect stage. Disaccharidases against maltose and sucrose were more evident in the 2nd and 3rd day of larval development and in the adult stage, respectively. Glycosil-hydrolyses with higher specific alpha-galactosidasic and beta-galactosidasic activities were detected in the 2nd and 3rd day of the larval stage, respectively. Specific proteolytic activities against azocasein showed an increase in the 4th and 5th day of the larval stage and in the adult stage. Specific hemoglobin activities were constant between 2nd and 6th day of the larval stage. The larvae used mainly serine proteinases, such as trypsin/chymotrypsin, and the adult insects only chymotrypsin-like enzymes in their digestive process. Two serine proteinases were separated from zymogram between the 4th and 5th day of larval development and in the adult stage. Effect of soybean trypsin inhibitor (SBTI, a serine proteinase inhibitor) on development of C. capitata was examined by bioassay. C. capitata was susceptible to SBTI which affected larval mass at ED50 3.01%.     

粘虫不同发育期体内储存蛋白的检测及苦皮藤素Ⅴ对其含量的影响

采用PAGE和SDS-PAGE以及Western blot 的方法,分析了粘虫Mythimna separata幼虫、蛹及成虫体内的储存蛋白。结果表明,粘虫体内存在两种储存蛋白,其中一种为SP-1,即幼虫特异性储存蛋白,从6龄粘虫幼虫的2日龄开始出现在血淋巴中,到末日龄时达到峰值,停止取食后从血淋巴中消失;另一种为SP-3,在化蛹时开始出现在脂肪体中,一直到成虫期仍可持续表达,因此属于持续性储存蛋白。SP-1为分子量约94 kD和100 kD的2种亚基组成的蛋白质,而SP-3为分子量约94 kD的1种亚基组成的蛋白质。SP-1含8.16%的芳香类氨基酸,3.06%的甲硫氨酸。经苦皮藤素Ⅴ亚致死剂量处理5龄粘虫幼虫后的6龄2、3、4日龄粘虫幼虫体内储存蛋白的含量明显低于对照组,对5日龄后粘虫处理组和对照组体内储存蛋白的含量及雌性成虫产卵量没有明显影响。     

棉铃虫叉头框蛋白A类似蛋白基因HarmFoxAl的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生长发育的调控通路提供依据。【方法】从棉铃虫幼虫中肠中扩增得到HarmFoxAl的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HarmFoxAl的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌Escherichia coli Transetta菌株,IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并利用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白。通过qPCR检测棉铃虫不同发育阶段(1-6龄幼虫和预蛹),6龄幼虫不同组织(脂肪体、中肠、体壁和头部)以及10 mg/g 2-十三烷酮处理6龄幼虫不同时间后中肠中HarmFoxAl的表达谱。【结果】HarmFoxAl(GenBank登录号:XM021331806)的开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为25.03 kD和6.34。氨基酸序列分析表明,HarmFoxAl单体蛋白无信号肽、跨膜区和二硫键,核心区域是由4个α螺旋和3个β折叠组成的球状结构。将重组的Transetta (pET32a-HarmFoxAl)菌株用0.5 mmol/L IPTG在25℃条件下诱导5 h,约45 kD的融合蛋白His-HarmFoxAl能以可溶的形式存在于重组菌中,这与预测的分子量(42.8 kD)相一致。发育阶段特异性表达谱表明,HarmFoxAl在棉铃虫1-3龄幼虫期、6龄幼虫期和预蛹期均有表达,且预蛹期的表达量最高。组织表达谱结果表明,该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠和体壁中表达,且脂肪体内的表达量最高,而在头部中不表达。10 mg/g 2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠中HarmFoxAl的表达量显著降低,但随着时间延长其表达量逐渐升高,处理48 h后表达量显著高于对照。【结论】棉铃虫HarmFoxAl在预蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理幼虫后HarmFoxAl的表达量急速降低后逐渐升高,推测其在棉铃虫变态发育和解毒代谢过程中发挥重要作用。     

家蚕胚胎发育时期的蛋白质变化及构造分析

采用蛋白质双向电泳技术及蛋白质氨基酸序分析技术,从蛋白质水平研究了家蚕胚胎发育时期的基因表达情况。结果表明,从家蚕临界期胚胎直到点青期胚胎的较长一段时间内,蛋白质的双向电泳图变化不大,匹配蛋白质斑点率达６３．０％,卵特异性蛋白质,３０Ｋ蛋白质的含量很大。     

TMOF-like factor controls the biosynthesis of serine proteases in the larval gut of Heliothis virescens.

Proteolytic enzyme biosynthesis in the midgut of the 4th instar larva of Heliothis virescens is cyclical. Protease activity increases immediately after the molt from the 3rd to the 4th instar larvae and declines just before the molt into the 5th instar. Characterization of the midgut proteases using soybean tryspin inhibitor (SBTI) Bowman Birk Inhibitor (BBI) 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoride (AEBSF) and N-tosyl-L-phenylalanine chloromethylketone (TPCK) indicate that protease activity is mostly trypsinlike (80%) with a small amount of chymotrypsinlike activity (20%). Injections of late 3rd and 4th instar larval hemolymph into H. virescens larvae inhibited tryspin biosynthesis in the larval midgut. Similar results were obtained when highly purified 4th instar larval hemolymph that crossreacted with Aea-TMOF antisurm using ELISA was injected into 2nd instar larvae. Injections of Aea-TMOF and its analogues into 2nd instar, and Aea-TMOF alone into 4th instar larvae stopped trypsin biosynthesis 24 and 48 h after the injections, respectively. Injections of 4th instar H. virescens larval hemolymph into female Aedes aegypti that took a blood meal stopped trypsin biosynthesis and egg development. These results show that the biosynthesis of trypsin-like enzymes in the midgut of a lepidoptera is modulated with a hemolymph circulating TMOF-like factor that is closely related to Aea-TMOF. Arch.