鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的制备及分析

利用噬菌体抗体库筛选技术获得抗雄性特异性抗原的噬菌体Fab抗体,首次采用雄鼠脾细胞对鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库进行3轮亲和富集和2轮雌鼠脾细胞吸附,对筛选后特异性噬菌体Fab抗体进行ELISA分析,重组率鉴定及基因测序分析。结果显示,5次筛选后的15个菌落中有9个能产生抗雄性特异性抗原特异性噬菌体抗体,噬菌体Fab抗体的基因重组率为60%,E5克隆的重链、轻链可变区序列分别属于VH1和VκⅣ基因家族,这为挑选出高亲和力的抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体奠定了实验基础,将推进雄性特异性抗原及其抗体的研究进程,并为性别控制研究开创新途径。     

人源抗EPO基因工程抗体重链可变区的克隆和鉴定

利用噬菌体抗体显示技术筛选 EPO的人源抗体 ,得到了抗 EPO的人源抗体的重链基因。此抗体基因在噬菌体表面呈现的抗体分子具有良好的抗体活性和特异性。为制备完整的、具有更高亲和力的抗体打下了基础。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位链置换基因工程抗体研究

为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造。以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库。经纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定。利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能。结果显示,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9 M。通过竞争ELISA对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白Ⅲ号抗原表位。通过链置换法成功获得1株全新的针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础。     

噬菌体抗体技术

抗体可变区的重键基因及轻链基因与线性噬菌体的包膜蛋白蛋白基因重组后,可以在噬菌体表面表达形成具有活性的抗体片段。通过抗原的直接筛选,可以分离得到特异性强,亲和力高的抗体分子,包括人抗体。本文就噬菌体抗体文库的构建,噬菌体抗体的分离及其应用作了简要介绍。     

血管内皮生长因子人单链抗体--基因克隆、高效表达、亲和力成熟及生物活性鉴定

利用抗体噬菌体展示技术, 克隆了血管内皮生长因子人基因工程单链抗体, 抗体表达量达菌体总蛋白的45%. 用层析柱复性技术同步完成抗体的纯化和复性. 生物活性实验表明, 该抗体不仅特异结合人VEGF165, 而且竞争抑制VEGF165与其受体的结合. 为了提高单链抗体的亲和力, 采用错配PCR法, 随机突变抗体重链可变区基因, 建立次级抗体突变库, 并从中筛选出高亲和力突变株. 研究了抗体突变株蛋白质三维结构特点及其与亲和力的关系, 这些结果不仅为肿瘤血管靶向治疗奠定了基础, 而且为抗体的高效表达及其亲和力体外成熟提供了参考模型.     

具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1二硫键稳定Diabody的制备

目的：对天然噬菌体抗体库进行筛选并对抗体进行体外亲和力成熟,获得高亲和力人源性抗PD-L1抗体,然后对该抗体进行二硫键稳定改造,获得具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1的二硫键稳定Diabody。方法：首先以PD-L1重组蛋白为抗原在天然噬菌体Fab抗体库中筛选Fab抗体,其次分析结合能力较好的抗PD-L1的Fab抗体可变区基因中的热点,通过对轻链、重链CDR3区的7处热点随机突变构建噬菌体抗体突变库,从中筛选出亲和力得到提高的抗体。最后在抗体骨架区引入两个二硫键,构建二硫键稳定的抗PD-L1的ds-Diabody,并在毕赤酵母GS115中进行表达。结果：该方法筛选获得了6株特异性抗PD-L1噬菌体Fab抗体,对结合能力较好的其中一株抗体CDR3区的热点进行随机突变,成功构建库容为1.14×10⁸ CFU/mL的噬菌体抗体突变库,并从中筛选出亲和力提高约6倍的噬菌体抗体突变株。对该抗体骨架区进行二硫键引入,成功构建与表达二硫键稳定的ds-Diabody。结论：构建的ds-Diabody比Fab抗体与PD-L1结合亲和力高、稳定性好,为药物开发、肿瘤治疗等研究P...     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达

目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(sc Fv),鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5'RACE技术扩增轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果:获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。     

抗破伤风类毒素单抗可变区基因的克隆及在大肠杆菌中表达的三种工程抗体

我们采用RT-PCR,从小鼠杂交瘤细胞中扩增并克隆了抗破伤风类毒素(TT)抗体轻、重链可变区,重链Fd区基因,测定了其VH、Vk序列。并在大肠杆菌中表达了Fd片段,ELISA分析的结果表明Fd片段具有抗原结合的能力,但特异性很差。进一步采用SOE,和PCR技术,将VH、VK基因与ScFv连接片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,以及将人重链CH1和Fab基因连接片段组装成Fab基因片段。将它们分别插入含噬菌体fd外壳蛋白3基因的phagem-id pHEN 1中,在辅助噬菌体M 13-VCS作用下,噬菌体表面表达了抗TT的噬菌体单链抗体(phage-ScFv)与噬菌体Fab(phage-Fab),经ELISA检测,表明它们都能与TT特异结合。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.