实时荧光定量PCR技术鉴别非O157∶H7大肠杆菌产志贺毒素菌株(STEC)的研究

本文运用实时荧光定量PCR的技术对菌株进行stx1基因、stx2基因、eaeA毒力基因检测;并对stx阳性、eaeA阳性的菌株进行O抗原基因rfbE(O157)、wzx(O26)、wbdI(O111)、ihp1(O145)、wzx(O103)检测。探究了实验室保存的94株非O157:H7大肠杆菌是否存在产志贺毒素菌株(STEC)存在;结果表明94株大肠杆菌中检出3株含有stx基因、12株含有eaeA基因;对stx和eaeA阳性菌株O抗原基因试验,检出2株含有wzx(O26)基;这2株大肠杆菌血清凝集试验结果为阳性。研究结果显示,实时荧光定量PCR技术具有特异性强,灵敏度高等特点,可用于产志贺毒素菌株(STEC)前期筛查。     

大肠杆菌O157:H7核酸探针检测方法的建立

目的：应用核酸探针方法快速检测大肠杆菌O157：H7。方法：通过使用吖啶酯标记的特异DNA探针方法检测大肠杆菌O157：H7,对此种方法的特异性、敏感性、准确性进行研究,比较该方法与传统国标法的检测结果。结果：核酸探针方法检测大肠杆菌O157：H7特异性以及敏感性强,检出大肠杆菌O157：H7菌液浓度最低限约为106cfu/ml,检测大肠杆菌O157：H7的结果与国标法相一致;对O157：H7鉴定时间仅需30min,简便快捷。结论：核酸探针方法可用于大肠杆菌O157：H7的快速检测。     

肠出血性大肠杆菌(O157：H7)的特异性荧光探针检测方法的建立

目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5’端用FAM基团标记,3’端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优化了大肠杆菌0157:H7的荧光定量PCR检测方法。结果:在人工污染样本无需富集的情况下,检测的最低DNA浓度是10拷贝/反应(3CFU/mL);特异性检测实验中,0157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非0157:H7菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批内、批间变异系数均小于3%。结论:实验结果显示此荧光定量PCR方法特异性、灵敏度高,重复性好,可对分离的可疑大肠杆菌0157:H7菌株进行快速鉴定。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的:建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法:研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法,用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果:结果表明该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101-1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102CFU/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5%。结论:本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的：建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法：研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果：结果表明该检测方法的特异性为100％,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×10^1-1×10^6拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×10^2CFU／ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5％。结论：本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌O157抗原的rfbE基因、 编码H7抗原的fliC基因以及编码毒力因子的eaeA基因为靶基因, 选择3对引物, 建立并优化了检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系, 扩增产物分别为291 bp、625 bp、368 bp, 采用30株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到91.35 pg; 在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhimurium)的情况下, 当起始污染量为1.4 CFU/mL时, 37 ℃培养6 h 即可检出。在30份肉类样品中, 有3份检出了大肠杆菌O157:H7。本研究建立的多重PCR方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测。     

复合探针荧光定量PCR方法的建立

为了对特定基因进行实时检测,根据荧光能量转移(FRET)原理,设计及合成了一种新的FRET复合探针,该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′端接一荧光素分子,3′端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针。无荧光产生,当有模板时,荧光探针与模板杂交,荧光不能被淬灭,产生的荧光与模板量成正比。根据复合探针的反应原理,研究了该探针的FRET性质及影响因素包括淬灭探针及扩增片段长度、荧光探针与淬灭探针的合适比例及镁离子浓度。实验结果显示淬灭探针及扩增片段长度对复合探针的作用有明显的影响,本实验采用淬灭探针长21个核苷酸,扩增片段长127bp,荧光探针与淬灭探针的合适比例为1：1,镁离子浓度为3mmo1／L,可获得最佳的反应体系;该复合探针合成简单,淬灭彻底,具有良好的准确性与特异性,敏感性达10^2拷贝,并具有较宽的动力学定量范围,可对10^2—10^9拷贝范围内的待检样品进行准确的定量。复合探针技术可应用于病毒感染水平、转基因拷贝数及单核苷酸多态性等检测。     

实时荧光定量PCR技术及其应用

实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术,该简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用。     

O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

大肠杆菌O157显色培养基检测效果的评价

【目的】评价显色培养基对大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的检测效果。【方法】本实验室研制的大肠杆菌O157显色培养基(HKM),与国外梅理埃、科玛嘉及国内厂家的同类产品及传统培养基CT-SMAC作比较,对相关菌株以及污染样品和实际样品进行对比测试。【结果】实验室研制的HKM大肠杆菌O157显色培养基与科玛嘉同类产品在特异性、灵敏度及检测效果方面均无明显差异,均优于梅里埃、国内厂家产品及CT-SMAC。【结论】HKM大肠杆菌O157显色培养基具有高检出率及高特异性的特点,具有较好的应用价值和前景。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H7 86-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株（缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp）,并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7 ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

分型检测致泻性大肠埃希氏菌PCR技术研究进展

致泻性大肠埃希氏菌是一类能够引起人类和动物腹泻的食源性致病菌,迅速确定致泻性大肠埃希氏菌的污染来源可有效缩小疫情影响范围,建立简便高效的致泻性大肠埃希氏菌检测与分型技术是保障食品安全和控制疫情的关键。为适应对时间敏感度较高要求的现场或在线检测,基于PCR技术的检测分型方法不断地被标准化和规范化。对近年来国内外的致泻性大肠埃希氏菌分子检测与分型的PCR技术研究进展进行了综述,并详细地介绍了多重聚合酶链反应、荧光实时定量聚合酶链反应和核酸等温扩增技术的原理及其优缺点。为致病菌溯源方法的选择提供参考,对防御并控制致病菌引起流行病传播具有重要的意义。     

TaqMan MGB Probe Fluorescence Real-Time Quantitative PCR for Rapid Detection of Chinese Sacbrood Virus

Sacbrood virus (SBV) is a picorna-like virus that affects honey bees (Apis mellifera) and results in the death of the larvae. Several procedures are available to detect Chinese SBV (CSBV) in clinical samples, but not to estimate the level of CSBV infection. The aim of this study was develop an assay for rapid detection and quantification of this virus. Primers and probes were designed that were specific for CSBV structural protein genes. A TaqMan minor groove binder (MGB) probe-based, fluorescence real-time quantitative PCR was established. The specificity, sensitivity and stability of the assay were assessed; specificity was high and there were no cross-reactivity with healthy larvae or other bee viruses. The assay was applied to detect CSBV in 37 clinical samples and its efficiency was compared with clinical diagnosis, electron microscopy observation, and conventional RT-PCR. The TaqMan MGB-based probe fluorescence real-time quantitative PCR for CSBV was more sensitive than other methods tested. This assay was a reliable, fast, and sensitive method that was used successfully to detect CSBV in clinical samples. The technology can provide a useful tool for rapid detection of CSBV. This study has established a useful protocol for CSBV testing, epidemiological investigation, and development of animal models.     

Real-time detection of Escherichia coli O157:H7 sequences using a circulating-flow system of quartz crystal microbalance

A DNA piezoelectric biosensing method for real-time detection of Escherichia coli O157:H7 in a circulating-flow system was developed in this study. Specific probes [a 30-mer oligonucleotide with or without additional 12 deoxythymidine 5′-monophosphate (12-dT)] for the detection of E. coli O157:H7 gene eaeA, synthetic oligonucleotide targets (30 and 104 mer) and PCR-amplified DNA fragments from the E. coli O157:H7 eaeA gene (104 bp), were used to evaluate the efficiency of the probe immobilization and hybridization with target DNA in the circulating-flow quartz crystal microbalance (QCM) device. It was found that thiol modification on the 5′-end of the probes was essential for probe immobilization on the gold surface of the QCM device. The addition of 12-dT to the probes as a spacer, significantly enhanced (P < 0.05) the hybridization efficiency (H%). The results indicate that the spacer enhanced the H% by 1.4- and 2-fold when the probes were hybridized with 30- and 104-mer targets, respectively. The spacer reduced steric interference of the support on the hybridization behavior of immobilized oligonucleotides, especially when the probes hybridized with relatively long oligonucleotide targets. The QCM system was also applied in the detection of PCR-amplified DNA from real samples of E. coli O157:H7. The resultant H% of the PCR-amplified double-strand DNA was comparable to that of the synthetic target T-104AS, a single-strand DNA. The piezoelectric biosensing system has potential for further applications. This approach lays the groundwork for incorporating the method into an integrated system for rapid PCR-based DNA analysis.     

Morphogenesis of Escherichia coli

Morphogenesis of the rod-shaped Escherichia coli is determined by controlled growth of an exoskeleton made of murein (peptidoglycan). Recent insights in the growth strategy of the stress-bearing murein sacculus has contributed to our understanding of how the required concerted action of murein polymerizing and hydrolyzing enzymes is achieved. The proteins involved are coordinated by the formation of multienzyme complexes. In this review, we summarize the recent results on murein structure and metabolism. On the basis of these findings, we present a model that explains maintenance of the specific rod shape of E. coli.     

大肠杆菌O157:H7噬菌体鸡尾酒喷雾干燥微囊粉剂的制备及其应用

【目的】提高噬菌体在常温环境下的保存稳定性,解决噬菌体鸡尾酒在体内失活的问题,为噬菌体对肠道疾病的治疗提供参考依据。【方法】本研究采用喷雾干燥技术制备噬菌体鸡尾酒微球粉末,通过单因素试验和正交试验确定最佳制备条件,并对其特性进行研究,比较其与游离噬菌体在常温环境和体内环境的稳定性差异,并通过口服给药的方式对大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7导致的肠道疾病进行治疗。【结果】本研究以海藻糖和亮氨酸组合为保护剂制备了一种具有热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末,试验结果显示,海藻糖和亮氨酸质量比为9:1时,设置进料速度为7.5 mL/min、海藻糖浓度为2%、入口温度为130℃、噬菌体鸡尾酒悬液与保护剂溶液体积比为1:50,噬菌体滴度损失最小,仅下降(0.623±0.235) log10 PFU/g。其在常温条件下保存6个月,噬菌体鸡尾酒滴度损失(0.862±0.082) log10 PFU/g,较游离噬菌体具有更长的保存稳定性,且其于体内环境的稳定性和治疗效果均优于游离噬菌体鸡尾酒。【结论】采用喷雾干燥法配合合适的保护剂配方可制得具有生物活性和热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末...     

利用重组大肠杆菌合成几丁寡糖的研究

提取根瘤菌Mesorhizobium.loti基因组,克隆编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶nodC基因,插入质粒pUC19的lac启动子的下游,构建并筛选出能够合成几丁寡糖的重组大肠杆菌DCL-3。利用优化的MMYNG培养基,重组大肠杆菌DCL-3在10L发酵罐中培养26h后,培养液菌体浓度测定OD560=10.8,几丁寡糖得率达到526mg/L。收集重组细菌的细胞并煮沸破碎,利用活性炭的吸附和P4凝胶层析对几丁寡糖产物进行分离纯化。纯化产物的液质分析(LC-ESI-MS)结果表明主要寡糖产物为几丁四糖(m/z,831[M H] )和几丁五糖(m/z,1034[M H] )。     

Transfection of Escherichia coli by Mu DNA

Summary Infectivity of Mu DNA was demonstrated in Ca⁺⁺-treated Escherichia coli cells that lacked the nucleases Exo V and Endo I. The efficiency of transfection is about 10^-7 per phage equivalent. Infectivity is destroyed by denaturation of Mu DNA, and cannot be restored by renaturation.