人外周血树突状细胞的形态学研究

血树突状细胞是一种重要的免疫辅助细胞,可以从外周血分离获得。本研究对自人外周血分离的树突状细胞进行了免疫细胞化学、透射电镜和扫描电镜观察。结果表明,血树突状细胞呈Ｓ—１００蛋白阳性反应,ｌｙｓｏｚｙｍｅ阴性反应。细胞形态不规则,有长短、粗细不等的突起,核不规则且多扭曲。体外培养时,血树突状细胞可互相接触,或数个聚集成群或与淋巴细胞形成花环。实验中发现Ｓ—１００蛋白阳性的血树突状细胞有两种不同的形态类型。文中除对血树突状细胞的生理功能进行了讨论外,还提出了这两类细胞很可能是外周血树突状细胞的前体细胞和成熟的树突状细胞。     

外周血树突状细胞的体外培养

本文用塑料贴壁的外周血单个核细胞(PBMNCs)在含自体血浆、rhGM-CSF、rhIL-4和TNFα的RPMI1640培养基,37℃,5%CO2湿化空气培养树突状细胞(DCs).经10天培养,可获得大量具DCs形态学特征的细胞,其有很强的刺激同种淋巴细胞增殖功能,约30%的细胞表达HLA-DR和CD1a.健康志愿者每1×107PBMNCs可收获细胞约5×105.本文培养方法产率高,培养体系简单,用自体血浆代替小牛血清,培养过程简便,这些均适应临床治疗要求.     

树突状细胞和抗原负载树突状细胞在肿瘤模型鼠体内的分布和形态学观察

目的:研究体外培养的小鼠树突状细胞(dentritic cells,DCs)和抗原负载树突状细胞在肿瘤模型鼠体内的分布和形态,为肿瘤的生物学治疗提供形态学基础.方法:分离和培养DC,制备B16黑色素瘤细胞抗原,进行共培养,即为抗原负载的DC,Brdu标记DC和抗原负载的DC,建立B16黑色素瘤小鼠模型,于瘤周围皮下注射Brdu标记的DC和抗原负载的DC.应用光镜、免疫组化方法和透射电镜观察DC和抗原负载DC在肿瘤模型鼠体内的分布和形态.结果:免疫组化染色显示Brdu标记的抗原负载DC与DC比较,体积较大.实验组Brdu标记的DC和抗原负载DC分布的数密度和面密度,分别与对照组比较,有显著差异(P＜0.01).电镜下抗原负载DC细胞与DC比较体积较大,核有切迹,细胞表面的突起较粗大弯曲,形态较成熟.结论:抗原负载DC比DC更易集聚于肿瘤组织周围,推测抗原负载DC比Dc可能诱导抗肿瘤效应更强.     

人血树突状细胞对LAK细胞抗H_（7402）细胞影响的形态学观察

本研究结合光镜免疫组化和组织化学方法,在光镜和电镜下观察了人外周血树突状细胞（ＤＣ）对ＬＡＫ细胞杀伤人肝癌Ｈ７４０２细胞的影响。结果显示,（１）ＤＣ不仅能与ＬＡＩＣ细胞形成花环,还能与ＬＡＫ、Ｈ（７４０２）细胞相互接触形成细胞簇,常见呈明显坏死状态的Ｈ（７４０２）周围有ＤＣ和ＬＡＫ细胞围绕;（２）与Ｈ（７４０２）＋ＬＡＫ细胞组相比,在Ｈ（７４０２）＋ＬＡＫ＋ＤＣ组中,肿瘤细胞的坏死程度明显加重。提示人外周血ＤＣ在细胞免疫抗肿瘤过程中起重要作用。     

重组腺相关病毒2型转导人外周血单核细胞来源树突状细胞的研究

To find out the infection efficiency of recombinant adeno-as sociated virus 2-mediated exogenou s genes in human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells(D Cs),the process of transfection wa s investigated by FITC-labeled rAA V2,and observed under confocal mic roscope.Newly separated dendritic cells were tranfected by rAAV2-luc and rAAV2-GFP at different MOI,and transfection efficiency were detec ted by luminometer for rAAV2-luc a nd flow cytometry for rAAV2-GFP.Th e results were elucidated in four different assay systems:(1)60min w as needed for rAAV2 to bind on den dritic cells,and got into cells in the following 10min;(2)the express ion of luc could be detected at th e MOI as low as 1×10~5v.g/cell,and the expression plateau was reached by the MOI of 10~6～10~7v.g/cell,furt her increase of MOI had no functio n on expression level;(3)transgene expression was detected after 48h, and maintained a higher expression level from 96h to 240h after infec tion;(4)7days postinfection of rAA V2-GFP,5%～18% dendritic cells were GFP positive. These data suggest th at rAAV2 vector can efficiently in fect monocyte-derived dendritic ce lls and mediate exogenous gene exp ression,and that the application o f rAAV2 as vector may be useful fo r gene transfer to dendritic cells in ex vivo immunotherapy.     

体外培养的小鼠抗原负载树突状细胞的形态学特征

目的:研究体外培养的小鼠抗原负载树突状细胞(dentritic cells,DCs)的形态学特征,为肿瘤的生物学治疗提供形态学基础.方法:分离和培养DC,制备B16黑色素瘤细胞抗原,进行共培养,即为抗原负栽的DC.建立B16黑色素瘸小鼠模型,于瘤周围皮下注射抗原负载的DC.应用光镜、免疫组化方法和透射电镜观察抗原负载DC的形态学特征.结果:培养的抗原负载DC与DC比较,体积较大,表面突起较粗大且弯曲.免疫组化染色显示抗原负载树突状细胞主要分布于肿瘤周围皮肤的乳头层、网织层和肿瘤周围,于局域淋巴结的被膜下窦和副皮质区有散在分布.电镜下抗原负载DC细胞体积较大,核有切迹,细胞表面的突起,与肿瘤细胞和淋巴细胞接触密切.结论:抗原负载DC表现出比一般树突状细胞功能更加活跃的形态特征,冻融法全细胞来源的肿瘤抗原负载DC可以获得理想的DC疫苗.     

人外周血树突状细胞体外诱导扩增的研究

目的:探讨可用于临床治疗功能成熟的DC体外扩增的优化培养方案。方法:胎牛血清培养基联合细胞因子rhGM-CSF(100ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)扩增人外周血分离的单个核细胞,细胞培养分别按5×106/mL、6×106/mL和7×106/mL的密度,加入6孔培养板。第6d加入rhTNF-a(100 ng/mL)联合培养,分别于第6 d,第9 d和12 d收获细胞。从形态学、细胞表面标志方面进行鉴定。结果:显微镜观察,经过9 d诱导后,培养细胞具有典型树突细胞外形。流式细胞仪分析,6×106/mL密度的细胞培养组培养到第9天最宜。结论:细胞具有典型的DC的形态特征,细胞表型及功能实验证实其DC的特性,说明建立的血清培养基联合细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a体外诱导DC的方法是切实可行的。     

登革病毒对人树突状细胞感染性的研究

探讨登革病毒对人树突状细胞(DC)的感染性。人外周新鲜血常规分离单核细胞,经细胞因子GMCSF、IL4诱导培养成DC,通过形态学特征、细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。用登革病毒2型(DV2)感染DC,于作用后6h、24h、48h、72h、96h分别收集上清液和细胞,甲基纤维素微量空斑试验测定病毒滴度,间接免疫荧光法检测细胞上病毒抗原表达,透射电镜观察病毒在细胞内的定位。病毒感染后6h即可在培养上清中测出病毒,病毒滴度在48h达到高峰,以后逐渐下降。间接免疫荧光法证明感染的DC胞浆及胞膜上携带病毒抗原。透射电镜下在病毒感染48h后DC胞浆内可见大量病毒颗粒。树突状细胞是登革病毒感染的靶细胞,病毒可感染DC并产生大量病毒颗粒,可能在其发病机制中起重要作用。     

人喉癌组织中浸润树突状细胞抗原提呈效应的形态学研究

目的:探讨人喉癌组织中肿瘤浸润树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cell,TIDC)肿瘤抗原提呈效应。方法:采用光镜、透射电镜和免疫组化方法观察28例手术切除的人喉癌中TIDC和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的形态学表现。结果:早期人喉癌组织中TIDC主要分布在癌周区及癌巢内,病变早期TIDC和TIL的浸润比晚期明显(P<0．01)。透射电镜下可见形态不一的TIDC和TIL广泛分布于癌巢边缘、游走于癌周边组织的血管和淋巴管周围。TIDC与肿瘤细胞、TIDC与TIL、TIL与TIL、TIL与肿瘤细胞之间存在多种形式的膜接触。与TIL接触的肿瘤细胞,细胞核均质化。细胞膜消失呈凋亡状态。癌晚期TIDC与TIL数量明显减少,于癌巢内常见凋亡的TIDC与TIL。结论:人喉癌组织中存在不同形态的TIDC与TIL,TIDC、TIL、癌细胞彼此密切接触发生免疫应答反应,TIDC、TIL的数量和活跃状态与肿瘤进展密切相关。     

小鼠肺脏间质树突状细胞形态学分布与观察

目的认识小鼠肺脏间质树突状细胞(dendritic cells,DC)的形态、数量和分布特点。方法运用光镜、电镜观察与免疫组化标记(CD11c、CD205、CD80、CD86及MHC-II类分子I-Ab)方法,观察研究C57BL/6小鼠肺脏间质树突状细胞的形态、数量和分布。结果小鼠肺脏间质树突状细胞具有与免疫器官及外周血中DC相同的超微形态特征;CD11c阳性DC含量约占肺脏总细胞数的8.5‰,广泛分布于肺间质中;表达CD205、CD80、CD86及I-Ab的成熟DC含量稀少,多位于间质血管周围。结论肺脏间质树突状细胞是一种脏器免疫前哨细胞,是肺脏免疫微环境的重要组成部分。     

人血树突状细胞培养后的形态及抗肿瘤活性

观察新鲜分离和经体外培养３６小时的人外周血树突状细胞ＤＣ。和ＤＣ３６的形态学及其对淋巴因子与植物血凝素激活的杀伤细胞（ＬＰＡＫ细胞）体外诱导人肝癌细胞株ＢＥＬ┐７４０２的促进作用。形成学观察用免疫细胞化学法。抗肿瘤实验分为三大组：（１）Ｌ组（ＢＥＬ┐７４０２＋ＬＰＡＫ）,（２）ＬＤ３６组（ＢＥＬ┐７４０２＋ＬＰＡＫ＋ＤＣ３６）,（３）ＬＤ０组（ＢＥＬ┐７４０２＋ＬＰＡＫ＋ＤＣ０）。各组均采用ＬＰＡＫ与ＢＥＬ┐７４０２为５∶１和１０∶１两种效靶比。培养４８小时后用中性红摄入比色法检测ＬＰＡＫ细胞的杀伤活性。结果显示,ＤＣ３６的形态以具有细长突起者为多,与ＤＣ０主要为园形或具有短而钝突起的形态有明显差别。各组的细胞毒活性依次为：ＬＤ３６组＞ＬＤ０组＞Ｌ组（Ｐ＜０．０１）,并随效靶比增高而相应增强。这表明新鲜分离的人外周血ＤＣ在体外经３６ｈ培养后,不仅在形态上成熟,而且抗肿瘤活性也明显增强     

人外周血淋巴细胞酶超微结构定位与活性研究

应用电镜酶细胞化学方法研究了人外周血淋巴细胞ＡＴＰ酶、Ｇ６Ｐ酶、５′ＮＤ酶的超微结构定位与活性。结果：１ＡＴＰ酶主要定位在淋巴细胞膜下方,在内质网及线粒体等膜相结构也见到此酶的分布。Ｇ６Ｐ酶主要定位在内质网、线粒体等膜相结构。５′ＮＤ酶主要定位在细胞膜外表面。三种酶定位准确,颗粒清晰。２此结果与我们对人体淋巴结淋巴细胞酶超微结构定位结果相同。结果提示应用电镜酶细胞化学方法可以检测人外周血淋巴细胞酶活性变化,对于判定免疫细胞功能状态,具有一定意义。     

人脐血CD34+细胞来源的树突状细胞疫苗在SCID小鼠体内的抗肿瘤免疫作用

目的观察脐血CD34 干细胞来源的树突状细胞(dendritic cells, DC)疫苗在严重联合免疫缺陷(severecombined immunity deficiency,SCID)小鼠体内对人肝癌细胞的免疫治疗和免疫保护作用.方法采用微磁珠分选系统(Mini MACS)从脐血单个核细胞中分离CD34 干细胞.重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombined human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)、重组人肿瘤坏死因子(recombined human tumor necrosis factor,TNF)-α诱导脐血CD34 细胞向DC分化,相差显微镜下观察DC分化过程中细胞的形态及数量变化.用人肝癌细胞BEL-7402裂解物冲击DC制备DC疫苗.在SCID小鼠体内观察DC疫苗致敏的淋巴细胞对人肝癌细胞的免疫治疗和免疫保护作用.结果脐血CD34 细胞在细胞因子诱导下,细胞形态由小变大、由圆形逐渐变为不规则形;细胞分裂扩增过程中,数量逐渐增多,形成细胞集落.经过细胞因子联合诱导2周的DC胞质突起丰富,具有典型的树枝状形态.在体内的抗肿瘤实验中,经DC疫苗致敏的人外周血淋巴细胞治疗荷瘤小鼠,肿瘤生长速度、瘤体积和重量明显小于未致敏淋巴细胞治疗组(P<0.05).与未致敏淋巴细胞免疫组和DC疫苗致敏的淋巴细胞治疗组比较,经DC疫苗致敏的淋巴细胞免疫SCID小鼠,肝癌细胞攻击后,肿瘤的发病率降低(P<0.05),发病潜伏期延长(P<0.01),肿瘤体积和重量减小(P<0.05).结论人脐血CD34 细胞来源的DC疫苗能在一定程度上抑制人肝癌细胞在小鼠体内的生长,抵抗肿瘤细胞的攻击,对机体具有相应的抗肿瘤免疫治疗和免疫保护作用.     

人正常腺上皮组织中MUC6基因的表达

应用免疫组织化学和原位杂交方法检测人正常腺上皮中MUC6基因的表达,揭示MUC6基因在正常人腺上皮组织中的分布异质性及其特点.结果显示MUC6基因编码的核心蛋白及其mRNA主要分布于正常胃粘膜胃腺的基底部,上皮细胞无MUC6基因表达,呈细颗粒状,位于细胞核周,胃底、胃窦的表达无区别;十二指肠绒毛上皮内的表达呈弥漫性,均质状,杯状和柱状细胞的表达类似,杯状细胞的粘液滴内未测得MUC6基因产物;空肠、结肠组织中无MUC6基因的表达;胆囊上皮组织内有强阳性MUC6核心蛋白的表达,而宫颈上皮中表达较弱.实验提示MUC6基因的表达存在异质性及器官特异性.     

人胚与鼠胚神经干细胞体外培养的差异

为比较人胚与鼠胚神经干细胞体外培养的差异。实验采用具有丝裂原作用的细胞生长因子。结合无血清细胞培养技术从人胚和鼠胚皮层分离神经干细胞。在连续传代过程中观察其体外培养特性,免疫荧光染色检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达,并用流式细胞仪检测神经干细胞分化情况。结果表明：（1）使用单一生长因子即可从鼠胚皮层分离神经干细胞,但在人胚却需同时使用多种生长因子,协同使用bFGF,EGF和LIF是人胚神经干细胞体外培养的较佳条件;（2）鼠胚皮层神经干细胞在连续传代过程中增殖速度快于人胚,其Nestin阳性率和BrdU标记的阳性率亦高于人胚,表明其增殖能力明显高于人胚,（3）人胚神经干细胞较鼠胚更易分化为神经元。     

人、猪、鼠血管内皮及平滑肌细胞培养与纯化方法的改进

对培养和纯化猪主动脉内皮细胞,人脐静脉内皮细胞,猪和鼠主动脉平滑肌细胞的方法进行改进。对其鉴定方法进行了讨论,用胶原酶或胰酶消化法,或机械法分别从猪主动脉,人脐静脉,鼠主动脉获得内皮细胞和平滑肌细胞进行培养,用光学相差显微镜,免疫组化的方法进行鉴定,结果显示,相差显微镜观察,人脐静脉内皮细胞接种后2-3小时贴壁,继而铺开生长,在视野内形成散在细胞团,细胞呈铺路石样排列的单层,随着传代次数增多,可见核分裂,双核及多核,猪血管内皮细胞呈鹅卵石样,多角形,生长分裂旺盛时可见两个或多个核,猪和鼠的平滑肌细胞在相差显微镜下外观为长梭形,细胞生长致密时排列成束,相互平行,并且重叠生长,表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。猪血管内皮细胞DiI-Ac-LDL染色,在荧光显微镜下显示特征性的黄绿色荧光,人Ⅷ因子抗原免疫组化检测人脐静脉内皮细胞,显微镜下可见核周胞浆呈现阳性反应,免疫组织化学法进行平滑肌细胞α-肌动蛋白染色,显微镜下见细胞浆内着色,本介绍的培养及纯化猪血管内皮细胞,猪平滑肌细胞,鼠平滑肌细胞的方法简便易行。     

人胎垂体生长激素样免疫反应细胞的发育

为探讨人胎垂体生长激素细胞发育规律,本文用免疫细胞化学结合图像分析,研究１９例不同胎龄人胎垂体生长激素细胞的形态、大小、光密度变化。结果如下：①胎１６周已存在生长激素免疫反应细胞,随胎龄增加,细胞多排列成团或索,并由周边部向远侧部的中央延伸。②随胎龄增加,生长激素样免疫反应细胞数量逐渐增多,细胞逐渐增大,胞浆逐渐增多,核浆比值逐渐变小。至胎龄３２周,生长激素样免疫反应细胞以大型细胞为主,多为圆形或卵圆形。③生长激素样免疫反应细胞的光密度随胎龄增加而逐渐增高,２６周达高峰,以后呈下降趋势,但仍高于２４周的水平,结果提示：垂体生长激素细胞的发育是从幼稚到成熟的过程,生长激素细胞的功能在胎２４－２６周最旺盛。     

氢化可的松诱导特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞凋亡和增殖抑制

探讨氢化可的松对儿童急性特发性血小板减少性紫癜（AITP）外周血淋巴细胞增殖和凋亡的影响,对12例确诊的儿童AITP外周血淋巴细胞进行体外培养,用流式细胞术观察糖皮质激素处理后外周血淋巴细胞凋亡数量的变化,并用Wst-1（四氮唑盐）测定代表增殖的活细胞数。结果显示,激素处理组淋巴细胞凋亡率明显高于对照组,而活细胞数则明显低于对照组;激素处理后的外周血淋巴细胞凋亡率明显高于对照组,而活细胞数则明显低于对照组;激素处理后的外周血淋巴细胞凋亡率也明显高于处理前和正常对照组,均具有显性差异。结果表明,氢化可的松具有明显的诱导淋巴细胞凋亡和增殖抑制作用,说明糖皮质激素可通过诱导AITP外血淋巴细胞凋亡和增殖抑制发探治疗作用。     

人胎视网膜SOD免疫阳性细胞的发育与细胞凋亡

选择不同胎龄的人胎18例,用免疫细胞化学ABC法和TUNEL法观察人胎视网膜超氧化物歧化酶（SOD）免疫阳性细胞的发育和细胞凋亡。结果显示;（1）E15w节细胞层开始出现SOD免疫阳性细胞,E20w和E28wSOD免疫阳性细胞排列较整齐,分布于视网膜的外核层,内核层,节细胞层;E40wSOD免疫阳性细胞主要集中于视网膜的外核层,内核层,节细胞层,其数量增多,特别是内核层SOD免疫阳性细胞增多明显。（2）TUNEL法标记的视网膜凋亡细胞胞核具有指环状典型的凋亡特征,E12w人胎视网膜未见凋亡细胞,E15w,E17w凋亡细胞较多,大小不一,分布于视网膜的全层;E20w凋亡细胞主要集中在内核层,数量减少,E28w凋亡细胞仅见于内核层,胞核呈指环样外观,着色较深,但数量较E20w进一步减少;E40w视网膜全层未见凋亡细胞。结果提示,E28w视网膜SOD抗氧化酶系,光感受的基本结构初步发育成熟,其抗氧化保护作用可能主要来源于内核层的SOD免疫阳性细胞。