树qu免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿，这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此，寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树qu对许多重要的医学病毒易感，为了探讨树qu是否可以感染HIV-1，利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株，体外感染云南野生成年树qu的淋巴细胞和单核/巨噬细胞；同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在，用PCR法未能发现树qu的这些免疫细胞中有前病毒DNA，用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树qu细胞的表面检测到特异抗原；而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树qu的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1，可能的原因是树qu的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

树鼩免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV 1)的动物只有黑猩猩和长臂猿 ,这严重阻碍了HIV 1的疫苗研究和治疗研究。因此 ,寻找新的可以感染HIV 1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树对许多重要的医学病毒易感 ,为了探讨树是否可以感染HIV 1,利用不同辅助受体的 5种HIV 1病毒株 ,体外感染云南野生成年树的淋巴细胞和单核 /巨噬细胞 ;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在 ,用PCR法未能发现树的这些免疫细胞中有前病毒DNA ,用流式细胞术也未能在这些感染HIV 1的树细胞的表面检测到特异抗原 ;而感染HIV 1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV 1,可能的原因是树的这些免疫细胞的HIV 1受体 (CD4)和辅助受体 (CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大     

树Ju免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了ＨＩＶ－１的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染ＨＩＶ－１的动物模型成为十分迫切的课题。已知树Ｊu对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树Ｊu是否可以感染ＨＩＶ－１,利用不同辅助受体的５种ＨＩＶ－１病毒株。体外感染云南野生成年树Ju的淋巴细胞和单核／巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ和流式细胞术分别进行了检测,用ＲＴ－ＰＣＲ方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用ＰＣＲ法未能发现树Ｊu的这些免疫细胞中有前病毒ＤＮＡ,用流式细胞术也未能在这些感染ＨＩＶ－１的树Ｊu细胞的表面检测到特异抗原;而感染ＨＩＶ－１的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树Ju的这些免疫细胞在体外未能感染上ＨＩＶ－１,可能的原因是树Ｊu的这些免疫细胞的ＨＩＶ－１受体（ＣＤ４）和辅助受体（ＣＣＲ５或ＣＸＣＲ４）与人的免疫细胞胞差别较大。     

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×105TCID_(50)/m L。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

CA16感染树鼩肺成纤维细胞模型的建立及其受体SCARB2的表达

目的 探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法 用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB2蛋白的表达情况,探针法实时荧光定量PCR检测病毒载量,以β-Actin作内参染料法实时荧光定量PCR检测受体SCARB2基因的相对表达量,结合基因序列比对,分析其与感染的相关性。结果 CA16感染TSLF,可引起明显的细胞病变,免疫荧光实验可见病毒和受体SCARB2蛋白,以100TCID50/10^5 cells的比例感染TSLF可在48 h左右病毒载量达到最高,SCARB2基因有与感染相关的高表达,而其基因序列也与人有较高同源性。结论 CA16可感染TSLF,树鼩SCARB2可参与感染。     

树鼩细胞周期蛋白T1 cDNA的克隆和序列分析

树鼩细胞不能感染HIV-1,但支持HIV-1进入靶细胞后的转录,可能是因为树鼩细胞周期蛋白T1(tsCycT1)能结合HIV-1的Tat蛋白。通过设计引物,用RT—PCR技术,获得全长为2175bp tsCycT1基因的cDNA。其核苷酸序列与人的CycT1(hCycT1)基因的cDNA有92．6％的相似性;由此推导出的氨基酸序列有94．1％相似性。其中,hCycT1和tsCycT1氨基端的1—272个氨基酸的相似性高达98．8％,氨基酸第261位点为半胱氨酸。这些结果提示,tsCycT1会和HIV-1的Tat结合,形成高亲和的、锌依赖的复合物,支持HIV-1转录。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

呼肠孤病毒感染的树鼩中三类CD分子及IFN-γ表达变化及特征

目的探讨树鼩呼肠孤病毒激起机体免疫变化的特征,为树鼩的病毒防范提供理论基础。方法选取40~50日龄的树鼩分为三组(MRV1/TS/2011病毒株、MRV3/TS/2013病毒株和空白对照),通过灌胃后,采集第1、8、14、21、28天尾静脉血样,RT-PCR检测病毒载量、流式细胞术检测CD4/CD8/CD19、ELISA检测IFN-γ。结果感染第14天,MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013组的树鼩病毒载量、CD_4~+及CD19+细胞数量达峰值,其中经MRV1/TS/2011感染后第1天CD_4~+就有较高表达且数值与对照组相比差异有显著性,CD_8~+细胞数量及IFN-γ表达量在感染后第21天达到峰值。CD_4~+经MRV1/TS/2011感染后表达量更高,CD_8~+经MRV3/TS/2013感染后表达量更高。结论初步得出MRV1/TS/2011及MRV3/TS/2013感染机体后,随病毒载量变化,CD4/CD8/CD19及IFN-γ产生的变化规律:MRV1/TS/2011感染前期主要激起机体体液免疫,CD_4~+细胞发挥主要作用;MRV3/TS/2013可能主要影响机体细胞免疫,体液免疫只在病毒表达量显著升高及感染后期发挥作用,CD_8~+细胞和IFN-γ通过细胞免疫参与抗病毒反应。CD_4~+细胞可能对1型呼肠孤病毒更敏感,而CD19细胞+可能对3型呼肠孤病毒更敏感。对树鼩呼肠孤病毒的感染特征研究和树鼩本身的病毒防范有一定指导意义。     

细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染抑制作用的研究

人CCR5Delta32突变个体能有效抵制HIV-1感染,主要是由于该个体淋巴细胞内表达的CCR5Delta32突变蛋白能通过反式显性失活效应(TDN)抑制细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的产生．通过构建CCR5Delta32慢病毒载体,体外转染人外周血单个核细胞(PBMCs),研究细胞内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1感染的抑制作用．结果表明,表达CCR5Delta32蛋白的人PBMCs对HIV-1 R5、X4及R5X4毒株感染均具有显著的抑制作用．这些工作为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础．     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。     

树鼩呼肠孤病毒的分离鉴定

致病性病毒严重危害树鼩(treeshrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径~75nm。纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3:3:4排列。哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株(T3/Bat/Germany/342/08)同源性最高。MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据。     

滇西亚种树鼩体外寄生虫自然感染状况及分析

目的调查滇西亚种树鼩体外寄生虫的自然感染状况,为建立树鼩质量控制标准提供依据。方法对野生的滇西亚种树鼩和自繁F1代树鼩各60只分别用尸检法和活体法检测,随即采用拔毛或用透明胶带粘取腋下、耳根、腹股沟、肛门附近等处的毛发制片,置于体视镜和显微镜下观察虫体和虫卵。结果野生滇西亚种树鼩和自繁F1代树鼩体外寄生虫自然感染率分别为：虱子25%/6%、蚤5%/0、蜱1.6%/0、水蛭1.6%/0、虱子和蚤混合感染1.6%/0。结论野生树鼩体外寄生虫的自然感染多为虱子和蚤,其次还有蝉、水蛭,总感染率明显高于自繁F1代。使用灭虱灵对于驱除树鼩体外寄生虫具有较好的疗效。     

树鼩驯养繁殖实验动物标准及丙型肝炎动物模型技术平台建设的探讨

目前用于生物医学研究的树鼩大多数来源于野生捕获,由于个体间的差异较大,其实验结果的均匀性和可重复性较差,亟待解决树鼩人工饲养设施条件、繁殖关键技术、动物质量标准等一系列基础科学问题。许多文献报道了树鼩与其他实验动物比较,在肝病研究中具有巨大的开发应用潜力,在丙型肝炎动物模型研究中,亟待解决丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系、HCV病毒感染剂量与感染途径、HCV病毒对树鼩体外、体内感染后病毒核酸检测、抗体检测和病理检测等技术方法的建立及动物模型评价标准问题。本文就上述问题系统性地进行初步报道,旨在为树鼩早日实现实验动物化和丙型肝炎疾病研究中应用提供科学依据。     

树鼩(Tupaia belangeri)淋巴细胞的自体花结

参与人自体花结(A花结)形成的分子(如CD2/LFA-3),与免疫细胞的粘附和激活有关。我们曾发现,人和猴淋巴细胞表面的树鼩红细胞(TRBC)受体不同于绵羊红细胞(SRBC)受体(CD2),可能是一种新的白细胞分化抗原。花结试验表明,树鼩的外周血淋巴细胞(TPBL)和胸腺细胞都能形成A花结,结花率分别为20.9％和11.1％;而绵羊红细胞花结(E花结)形成率分别是20.9％和1.1％。以四种单克隆抗体(McAb)(Leu 5,0-275,AICD2.1和E2 McAb)进行树鼩A花结和E花结的抑制与抗原调变试验,结果表明,这些抗体对树鼩的A花结都没有明显的抑制或调变作用,但对E花结的抑制及调变作用明显。说明TPBL表面的TRBC受体不同于SRBC受体,与CD2/LFA-3及E2分子无关。因此,TPBL的A花结与E花结形成机制不同。     

以J-Lat 11.1为HIV-1潜伏感染模型再激活效果检测方法的初步探讨

目的:比较3种检测方法的优缺点,探索全面评价人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潜伏感染再激活剂的检测方法。方法:以HIV-1潜伏细胞株J-Lat 11.1为潜伏感染模型、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)为潜伏再激活剂,用流式细胞术检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞所占比例,酶标仪检测GFP表达强度,活细胞成像系统检测GFP的动态表达情况。结果:流式细胞术检测显示PMA再激活出GFP阳性细胞的比例随作用浓度的增加(0~10 nmol/L)而增加,但当PMA浓度高于10 nmol/L后变化不再明显;酶标仪检测显示PMA处理后24 h内,GFP荧光强度逐渐增高,之后可在高水平保持至48 h;活细胞成像系统则可以动态反映PMA处理后的再激活过程。结论:可采用流式细胞术检测GFP阳性细胞比例对HIV-1潜伏感染再激活剂进行初步筛选,再结合酶标仪或活细胞成像系统动态监测GFP的表达情况,综合评价再激活剂的作用强度和起效时间。     

趋化因子共受体在1型人免疫缺陷病毒感染中的作用

1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染靶细胞是一个包含病毒膜蛋白和细胞膜受体相互作用的多极化过程,CCR5和CXCR4作为趋化因子受体参与这一过程,并且是M嗜性和T嗜性HIV-1感染的重要共受体。文章总结了作者在HIV-1共受体方面的工作,对趋化因子受体作为新的治疗HIV-1感染的工具的最新进展做了简要综述。