一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建 |
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引用本文: | 孟祥亮,王宁新,牛丽华,李培光,李洋,黄大卫.一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建[J].生物技术通报,2013(9):62-67. |
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作者姓名: | 孟祥亮 王宁新 牛丽华 李培光 李洋 黄大卫 |
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作者单位: | 山东农业大学植物保护学院;中国科学院动物研究所 |
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基金项目: | 国家自然科学基金项目(NSFC 31101634) |
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摘 要: | 为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。
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关 键 词: | 逐次退火 重叠区域PCR 突变 拼接 |
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