Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

真核生物tRNA基因的表达

真核生物ｔＲＮＡ基因的表达金由辛（中科院上海生化所分子生物学国家重点实验室,上海２０００３１）真核细胞的生长周期真核生物ｔＲＮＡ基因的表达研究远落后于蛋白质基因的表达研究。原因很明显：１。ｔＲ－ＮＡ基因表达的终产物为ＲＮＡ,它在中心法则遗传信息传递过程中才走了半程;2。蛋白质基因表达受基因工程的推动。     

改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列

对传统的反向PCR技术作了一些改进：用巢式PCR扩增含量极少的靶序列;PCR反应体系中加入5%的甲酰胺以减少非特异性扩增.结果表明,改进的反向PCR体系是克隆人基因组已知片段旁侧序列的高度灵敏、高度特异的方法.     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

抗除草剂转基因大豆插入拷贝数及其旁侧序列分析

目的:确定抗除草剂转基因大豆外源基因拷贝数和其插入位点侧翼序列.方法:采用绝对定量PCR法测定转EPSPS基因大豆中外源基因拷贝数,内参照基因标准曲线选用大豆凝集素(Lectin)基因为标准品,外源基因标准曲线以含EPSPS基因的阳性质粒为标准品.采用基因组步移技术和巢式PCR方法确定抗除草剂转基因大豆插入位点旁侧序列.结果:抗除草剂转基因大豆外源基因的拷贝数为1.CaMV35S上游扩增887bp,NOS下游扩增1 340bp.结论:明确了EPSPS外源基因在转基因大豆中为单拷贝,转基因大豆插入位点附近大豆基因组发生了DNA重排.     

转基因水稻BPL9K-2事件特异性检测方法的建立

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带。该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0. 1%的模板中检测出转基因成分。依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。     

转基因玉米NK603品系特异定量PCR检测方法的建立

目的:建立转基因玉米NK603品系特异定量PCR检测方法,为转基因玉米NK603提供科学的定量检测依据。方法:根据转基因玉米NK603外源基因的旁侧序列设计引物和Taqman探针,建立转基因玉米NK603品系特异定量PCR检测方法,并采用该法检测2%含量的NK603标准品(不确定度为10%)。结果:采用构建的方法获得标准曲线斜率为-3.6~-3.1,相关系数大于0.99,扩增效率为100.2%,在90%~110%范围内;样品检测结果(1.9%)接近已知含量(2%,不确定度为10%)。结论:建立的转基因玉米NK603品系特异定量PCR检测方法的准确度较高,可在日常检验中推广应用。     

应用接头PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点旁侧序列

目的为鉴定慢病毒介导的转基因小鼠中外源基因的整合位点信息,应用接头PCR克隆整合位点旁侧序列。方法小鼠基因组总DNA酶解后与设计的接头片段连接,根据慢病毒的LTR序列设计巢式PCR引物,克隆转基因小鼠整合位点旁侧序列。结果成功克隆到转基因小鼠整合位点的旁侧序列,经过测序定位于小鼠染色体上。结论作为反向PCR的改进,本方法可用于转基因小鼠整合位点旁侧序列的克隆,为分析整合位点与外源基因表达之间的关系等提供了科学依据。     

植物转基因整合座位的结构

通过农杆菌和直接DNA转移技术所获得的转基因植株都具有复杂的转基因座位, 转基因整合染色体和染色体区段是随机的, 但组织培养的选择作用表现为非随机性, 偏向整合于染色体的基因富集区。转基因座位除少数含有完整的单拷贝转基因之外, 大多数转基因座位中外源转基因片段、基因组片段和填充DNA相间而存在。转基因座位中转基因及基因组DNA片段产生缺失、重复和染色体的重排, 转基因的完整性对转基因表达具有重要作用。