露水草的根培养和β—蜕皮激素的形成

用加ＮＡＡ和ＢＡＰ的ＭＳ培养基,从露水草根、茎和叶的外植物诱导出根,并用升液式生物反应器成功地进行放大规模培养。胆甾醇和法呢醇对培养根的生长无明显影响,但胆甾醇能促进β－蜕皮激素的合成。     

蜕皮激素在动物界的发生

自 Butenandt 和 Karlson(1954)第一次从家蚕蛹成功地分离出结晶状态蜕皮激素(蜕皮酮)至今将近40年中,蜕皮激素研究取得了很大进展,研究对象从昆虫扩展到其他各类无脊椎动物;已鉴定出与蜕皮激素相关的化合物近200种,其中动物蜕皮激素61种和植物蜕皮     

蜕皮激素及其对蟹虾养殖业的影响

一、蜕皮激素概况昆虫和甲壳动物蜕皮激素的研究是本世纪四十年代开始的。当时日本学者福田等人曾对家蚕进行结扎、断头及器官移植等试验,发现蚕的前胸腺的分泌活动与蜕皮及变态有着内在的密切联系。1954-1956年,德国卡尔森等从蚕蛹中分离到微量天然蜕皮激素(50mg/1000kg),仅使用0.0075μg就可以使结扎的丽蝇腹部化蛹。1965年,由美国霍夫迈斯特等鉴定了α-蜕皮激素的化学结构,证明它是一种广泛存在于昆虫及甲壳类动物体内的甾族化合物(即类固醇)。后     

罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控和蜕皮信号通路相关基因的表达分析

蜕皮是罗氏沼虾重要的生理过程,为了探究罗氏沼虾蜕皮周期中内分泌调控与蜕皮通路中相关基因在蜕皮周期中的表达模式,阐明罗氏沼虾蜕皮的分子调节通路。本研究测定了罗氏沼虾肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮周期内蜕皮相关酶活性（谷氨酰胺合成酶,β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶）与蜕皮激素含量,并通过RT-qPCR分析了蜕皮信号通路中Mr-ETHR、MrFTZ-F1以及RXR、ECR和MIH基因在罗氏沼虾不同蜕皮周期内的表达模式。酶活测定结果表明,谷氨酰胺合成酶在血淋巴组织中活力高于肝胰腺组织（P<0.05）;β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶在肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮前期的活力远高于蜕皮后期（P<0.05）。在肝胰腺中几丁质酶在蜕皮后期活力显著高于其他时期（P<0.05）。肝胰腺和血淋巴组织中蜕皮激素含量在蜕皮间期最低,蜕皮后期达到最高,呈上升趋势。通过PCR扩增与测序验证获得了Mr-ETHR、Mr-FTZ-F1基因ORF全长序列,Mr-ETHR基因ORF全长1 173 bp,编码390个氨基酸;Mr-FTZ-F1基因ORF全长为1 206 bp,编码401个氨基酸。荧光定量结果表明Mr-ETH...     

营养对褐飞虱生长和繁殖信号通路的影响

【目的】昆虫感知外界营养状态,在体内营养信号通过许多信号通路进行传递,进而调控昆虫的生长和繁殖。本研究旨在为营养调控褐飞虱Nilaparvata lugens生长和繁殖的分子机制作出初步探索。【方法】在不同营养条件［100%浓度饲料(全纯人工饲料D-97, 对照)、50%浓度人工饲料和25%浓度人工饲料］下饲喂褐飞虱3龄第2天若虫至成虫,统计体重、发育历期、存活率和每卵巢成熟卵量;利用荧光定量PCR检测羽化后第2天褐飞虱成虫不同组织(卵巢、脂肪体和其他组织)中IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因(InR1, InR2, AKT, FoxO, TOR, S6K, 4EBP, AMPKα,AMPKβ和AMPKγ)的表达量;利用Western blot方法检测羽化后第6天褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平;同时检测羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平以及不同龄期褐飞虱体内保幼激素(juvenile hormone, JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)滴度。【结果】与饲喂100%浓度人工饲料的对照相比,用低浓度人工饲料饲喂褐飞虱至成虫导致5龄第2天至成虫体重显著降低,从3龄第2天若虫至成虫发育历期缩短,死亡率提高,每卵巢成熟卵量显著降低。取食低浓度人工饲料后,羽化后第2天成虫IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因InR2, TOR, 4EBP, AMPKα在卵巢、脂肪体和其他组织中, AKT, S6K和AMPKγ在脂肪体和其他组织中,以及InR1, FoxO和AMPKβ在其他组织中表达量较对照均显著下降,但卵巢中InR1, AKT, FoxO和AMPKγ的表达量相对稳定;羽化后第6天成虫卵巢和其他组织中AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平显著增加。随着人工饲料饲喂浓度的降低,羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平显著增加。不同营养条件下褐飞虱4龄第2天若虫体内JH滴度无显著差异,低营养条件下5龄第2天若虫体内JH滴度较对照显著降低,而在羽化后第2天成虫体内JH滴度则较对照显著增加;低营养条件导致褐飞虱若虫以及成虫体内20E滴度均显著增加。【结论】褐飞虱在面临营养缺失的情况下,营养信号传导通路(IIS, TOR以及APMK通路)的关键基因表达均下降,而ROS水平显著上升,通过调节AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平,进而影响JH以及20E的生物合成。     

低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

【目的】本研究旨在明确破茧率和破茧所需时间作为典型的专性幼虫期滞育昆虫麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育解除指标的可行性,探讨蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90在低温解除滞育中的作用。【方法】9月上旬采自田间的麦红吸浆虫滞育幼虫在低温(4℃)和自然变温处理不同时间(0~90 d)后转移至24℃化蛹,调查幼虫的破茧率、化蛹率及破茧和化蛹所需时间;采用qPCR技术分析4℃低温终止滞育并在24℃下恢复发育的幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的mRNA水平。【结果】不同时间低温(4℃)和自然变温处理的麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率和化蛹率以及破茧和化蛹所需时间均存在显著差异。未经低温(4℃)处理的幼虫在水分满足的条件下破茧率为71.3%,但均不能化蛹;低温(4℃)处理60 d内,随着处理时间的延长破茧率和化蛹率逐渐升高,破茧和化蛹所需时间逐渐缩短;与4℃低温处理30~60 d相比,自然变温处理30~60 d的幼虫化蛹率显著较低;4℃低温处理60 d和自然变温处理90 d后幼虫的化蛹率均超过91%。低温(4℃)处理显著提高了麦红吸浆虫幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的表达量,其中处理30 d时其表达量最高,随着低温(4℃)处理时间的延长,表达量逐渐降低,大部分幼虫滞育解除后表达量趋于恒定。【结论】低温能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除,效果优于9-10月自然变温;破茧率及破茧所需时间可作为评判麦红吸浆虫幼虫滞育强度的参考,但不能独立作为滞育解除的指标;EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平与滞育强度密切相关,在麦红吸浆虫滞育解除中发挥潜在作用。     

家蚕BmChd64基因的克隆与表达定位分析

Chd64是含有钙结合蛋白同源（Calponin homology,CH）结构域的蛋白,在果蝇蜕皮激素与保幼激素信号通路中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为研究对象,利用PCR克隆了与果蝇Drosophila melanogaster DmChd64同源的BmChd64基因,与表达载体pET-28a连接后,成功获得体外原核表达的BmChd64蛋白,并对其进行了亚细胞定位分析。家蚕BmChd64基因开放阅读框（ORF）的序列为567 bp,编码188个氨基酸,预测分子量大小为20.9 kDa,理论等电点为8.41,编码的蛋白在第27~130个氨基酸处存在CH结构域。同源性比对与进化分析显示,BmChd64与赤拟谷盗Tribolium castaneum和果蝇的Chd亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BmChd64在家蚕5龄游走期的不同组织中均有表达,且在翅原基中的表达趋势与家蚕体内蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度变化规律一致。亚细胞定位结果显示,BmChd64在细胞核与细胞质中均有分布,细胞核内荧光信号较强,且在细胞核外围较弱,推测细胞质中BmChd64也可入核,最终定位在细胞核中。研究结果表明BmChd64可能主要通过20E信号通路调控翅原基等的变态发育,这为进一步完善20E调控昆虫变态发育的分子机制提供了实验基础。     

蜕皮激素和有效霉素对粘虫几丁质合成酶B基因表达的影响

【目的】克隆粘虫Mythimnaseparata几丁质合成酶B基因的全长cDNA序列,研究该基因的时空表达特性,分析蜕皮激素(20-hydroxy ecdysone, 20 E)和有效霉素(Validamycin)对该基因表达水平的影响。【方法】本试验通过高通量测序法获得粘虫几丁质合成酶B基因的cDNA全长序列,利用RT-qPCR技术分析粘虫几丁质合成酶B基因在不同发育阶段和不同组织的特异性表达及蜕皮激素和有效霉素对其表达的影响。【结果】基因cDNA全长4 617 bp,包含一个完整开放阅读框,编码1个1 538个氨基酸组成的多肽,分子量为175.629 ku,理论等电点为5.96,包含17个跨膜螺旋,4个几丁质合成酶的标签序列CATMWHET,DGD,EDR和QRRRW及1个催化结构域。该基因命名为MsCHSB,GenBank登录号为KY348776。氨基酸序列比对表明,该基因与其他昆虫的几丁质合成酶B基因同源性高于52%,其中与蓓带夜蛾Mamestra configurata和棉铃虫Helicoverpa armigera的几丁质合成酶B基因同源性最高,分别为92%和83%。RT-qPCR技术表明粘虫在不同发育阶段和组织中均有mRNA的特异性表达,其中3龄第1天和中肠中MsCHSB基因相对表达量最高。注射10μg/μL浓度的蜕皮激素6 h和12 h后,表现为对该基因的诱导效应,与对照组差异显著;有效霉素处理后该基因相对表达量均被显著抑制,其中注射20μg/μL浓度的有效霉素48h后,抑制作用最为明显。【结论】本试验得到了一条新的粘虫几丁质合成酶B基因cDNA序列全长。蜕皮激素对MsCHSB基因的表达有一定的诱导作用,有效霉素对MsCHSB基因的表达有一定的抑制作用,该结果为进一步研究昆虫几丁质合成酶B打下了基础。     

抑前胸腺肽在家蚕体内的活性作用

家蚕Bombyx mori抑前胸腺肽是昆虫脑神经肽的一种,体外实验表明它能抑制处于活动时期的家蚕前胸腺合成蜕皮激素,因此抑前胸腺肽可能对昆虫的变态起着重要的作用。将抑前胸腺肽以不同的浓度分单一注射和加强注射导入家蚕体内,不同的时间间隔取样,利用蜕皮激素放射免疫分析方法,观察到了抑前胸腺肽在家蚕体内的活性作用以及引起家蚕体内血淋巴中蜕皮激素浓度的动态变化,首次证明了抑前胸腺肽在体内对家蚕前胸腺合成蜕皮激素有强烈的抑制作用。     

桃小食心虫发育过程中蜕皮激素滴度动态及甲氧虫酰肼干扰滞育的作用

【目的】 经历了长光照和短光照条件,桃小食心虫Carposina sasakii脱果老熟幼虫分别进行非滞育和滞育发育。本研究旨在通过使用蜕皮激素类似物甲氧虫酰肼对桃小食心虫滞育进行干扰,以期达到干扰桃小食心虫滞育的目的,为开发桃小食心虫防治新方法奠定基础。【方法】 利用ELISA法测定了桃小食心虫幼虫滞育和非滞育过程中的20E滴度动态;以清水为对照,测定了不同浓度(0.05, 0.1, 1,2, 5, 7.5和10 mg/mL)甲氧虫酰肼以及0.5和1 mg/mL 20E喷沙处理对桃小食心虫结茧的影响;测定了5mg/mL甲氧虫酰肼和1 mg/mL 20E喷沙处理中桃小食心虫20E滴度,并跟踪调查了0.1和5 mg/mL甲氧虫酰肼喷沙处理对桃小食心虫滞育的干扰效果。【结果】两种光周期(15L∶9D和12L∶12D)下桃小食心虫滞育和非滞育幼虫生长过程中20E滴度没有差异,均是从幼龄到老龄逐渐降低,脱果时达到最低;但脱果时,长光照非滞育发育幼虫体内20E滴度(0.473 ng/g)显著高于短光照注定滞育幼虫体内的(0.254 ng/g)。非滞育发育幼虫脱果后进入长茧化蛹,虫体20E的滴度显著升高,在蛹期保持较高滴度区间(0.652~1.217ng/g)。滞育发育幼虫脱果后进入圆茧滞育,20E滴度缓慢上升,第4天达到第一个峰值(0.656 ng/g),随后降低,在第8天达到第2个峰值(0.790 ng/g);随着进入滞育稳定期,20E滴度逐渐降低;70 d后达到滞育解除状态,20E滴度持续保持在低滴度水平;第90天达到滞育期间最低滴度(0.424 ng/g),随后20E滴度开始上升。0.05 mg/mL甲氧虫酰肼点滴短光照桃小食心虫脱果幼虫,即可干扰部分滞育圆茧的形成,对桃小食心虫脱果幼虫的LD₅₀为7.039 μg/头。0.05 mg/mL以上浓度甲氧虫酰肼和20E喷沙处理均可有效干扰滞育圆茧的形成,1 mg/mL相同浓度的20E比甲氧虫酰肼表现出的干扰活性更高,两者均能使注定滞育的幼虫出现结长茧、畸形茧以及无法结茧的表型;在结畸形茧和无法结茧幼虫中20E滴度显著升高,5 mg/mL甲氧虫酰肼和1 mg/mL 20E喷沙处理不能结圆茧的比例分别为70.0%和66.7%,其中结畸形茧的幼虫体内20E滴度分别显著升高16.3%和143.0%,异常不能结茧的幼虫体内20E滴度分别显著升高149.3%和278.6%。部分幼虫接触甲氧虫酰肼后虽能够结圆茧,但能够完成滞育成功羽化的比例减少,甲氧虫酰肼0.1 mg/mL喷沙处理组羽化率仅为20.8%。【结论】 桃小食心虫幼虫在滞育过程中20E保持较低滴度,在生殖发育阶段需要较高滴度。外源甲氧虫酰肼和20E均能够干扰其结圆茧滞育,虫体结茧表型与20E滴度增加幅度具有相关性,相同浓度的20E比甲氧虫酰肼表现出更高的干扰活性;甲氧虫酰肼处理减少了桃小食心虫幼虫成功完成滞育的比例。