天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化

【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。     

天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌机制的研究

【目的】研究天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)DNA作用的抑菌机制。【方法】利用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)、凝胶阻滞分析、紫外光谱分析、荧光光谱分析的方法。【结果】天蚕素A-马盖宁杂合肽对MRSA的最小抑菌浓度(MIC)为64 mg/L,杂合肽可以在细菌胞内形成累积,并能与体外基因组DNA发生结合作用。同时杂合肽可以引起DNA构象的改变,荧光光谱分析结果表明杂合肽能与溴化乙锭(EB)竞争性地嵌入基因组DNA中,作用方式类似于EB与DNA的结合方式,杂合肽与DNA的结合表现为混合式作用方式。【结论】天蚕素A-马盖宁进入细菌胞内,与MRSA基因组DNA结合,并以混合式作用方式与DNA发生了结合,通过胞内靶向机制发挥抑菌作用。     

一种抗菌肽和aFGF融合蛋白的构建和表达

利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出表达质粒pET-aF-CM,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,氨苄青霉素抗性筛选重组转化子。IPTG诱导4h后,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的17%。将包涵体溶解后透析复性,并利用肝素亲和层析纯化,得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明,该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。MTT法检测显示,融合蛋白具有促3T3Bal/b细胞分裂活性,其比活为1.471×106IU/mg。利用凝血酶Xa因子裂解融合蛋白,可以获得抗菌肽和含凝血酶Xa因子裂解序列的aFGF蛋白。分子筛回收含杂合抗菌肽,抑菌活性检测表明其对大肠杆菌K12D31具有明显抑菌活性。微量稀释法检测结果表明,回收的抗菌肽对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达6.25μg/ml、10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml和5μg/ml。     

天蚕素和溶菌酶对中华鳖腐皮病预防效果的研究

为探讨天蚕素和溶菌酶对中华鳖Trionyx sinensis腐皮病的防治效果。本实验采用肌肉注射天蚕素(10 mg·kg~(-1))、溶菌酶(10 mg·kg~(-1))及天蚕素(6 mg·kg~(-1))和溶菌酶(5 mg·kg~(-1))混合物,观察其对鳗气单胞菌Aeromonas encheleia引起的中华鳖腐皮病的预防效果。以死亡率和相对保护率评价不同药物的保护效果;通过检测血清凝集效价、细胞吞噬功能和血清杀菌活力,比较不同药物对中华鳖免疫力和抗病能力的影响;比较庆大霉素和溶菌酶血药残留浓度,评估药物毒副作用。结果表明:天蚕素和溶菌酶二联法对中华鳖保护效果最好、免疫效果最佳,与其他组相比差异均有高度统计学意义(P0.01);血药残留分析表明,溶菌酶在用药后第6天全部代谢完毕,庆大霉素停药第12天仍有残留。天蚕素和溶菌酶二联法预防中华鳖腐皮病效果显著优于抗生素,无药物残留和耐药副作用,并提高免疫力,避免了应用抗生素所带来的危害,值得推广应用。     

食物对引种天蚕生长发育的影响

天蚕取食三种不同的栎属食物,对其死亡率、食叶量、幼虫期和产丝量等有明显的影响。研究结果表明：用白栎饲养的天蚕,其生长发育和产丝量等各项指标均优于用泡栎和栓皮栎饲养。白栎是天蚕最佳的寄主植物。     

抗菌肽Cecropin及其在转基因植物抗菌中的应用

Cecropin抗菌肽,又名天蚕素,是一类具有抗菌能力的小分子多肽,热稳定性好,抗菌谱广,在各个应用领域已经得到广泛的研究。本文就Cecropin抗菌肽结构与功能的关系、作用机制和其在转基因植物抗菌领域中的应用进行综述,转基因植物表达Cecropin抗菌肽具有应用优势和实用价值,Cecropin抗菌肽分子结构与作用机制探索的深入能进一步促进转基因植物抗菌研究的发展。     

融合基因Mdc-hly的构建及原核表达

构建家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)融合基因,实现Mdc-hly基因在大肠杆菌中的表达。通过RT-PCR分别扩增出家蝇天蚕素和人溶菌酶的成熟肽基因序列,再利用Gene-SOEing技术构建融合基因,将融合基因克隆至pET32a表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达,融合蛋白分子量约为38kD。Western blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。成功构建了融合其因并进行了原核表达,为进一步的生物活性研究打下基础。     

天蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

天蚕卵黄原蛋白cDNA的全碱基序列由5 720个碱基构成,一个开读框有5 334个碱基序列,编码了包括由15个氨基酸组成的信号肽在内的共1 778个氨基酸的蛋白质前体。天蚕和柞蚕卵黄原蛋白的同源性非常高,氨基酸序列达到92.6%,碱基序列达到94%。天蚕、柞蚕和家蚕的卵黄原蛋白的糖链附加位点(N-linkedg-lycosylationsite):柞蚕有4个,家蚕有5个,天蚕和家蚕相同保存着5个。在N-末端区域,天蚕和家蚕有多聚丝氨酸区域和可被胰蛋白酶识别的RSRR部位;柞蚕虽然也具有多聚丝氨酸区域,但没有可被胰蛋白酶识别的RSRR部位。在C-末端区域里,大多数昆虫从G ICG功能部位至C-末端结尾具有7个~10个半胱氨酸(Cys)。鳞翅目的4种昆虫柞蚕、天蚕、家蚕和舞毒蛾(A.pernyi,A.yam am ai,B.m ori,L.dispar)都是7个半胱氨酸。     

高温对珍贵绢丝昆虫——天蚕睾丸生长发育的影响

研究结果表明,高温对天蚕(Antheraea yamamai)睾丸生长发育有明显影响.3、4龄幼虫睾丸大小在20～29℃范围内随温度提高而增大,32℃下则略有下降;5龄幼虫睾丸大小在20～26℃范围内随温度提高而减小,其中以20℃下的睾丸极显著为大,在29℃和32℃下幼虫难以生存,睾丸几乎不可能发育.在茧蛹期,不论在刚结茧还是在化蛹第1天和第6天经受32℃高温持续处理,睾丸大小增长、精子发生明显受阻,睾丸中可溶性蛋白含量和精子形成数量明显下降.成虫期第1天受32℃高温处理时精子活力明显减弱.建议在天蚕制种前,结茧至成虫期茧蛹和雄蛾保护时切勿经受32℃高温冲击.此外就3、4龄和5龄幼虫饲育的适宜温度作了探讨.     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。