A prourokinase-RGDS chimera——Construction, expression and characterization

A tetrapeptide, RGDS, was inserted into proUK kringle domain G118-L119 by the construction of a mutant proUK-RGDS gene. The gene was expressed in the baculovirus expression system. Immunoaffinity chromatography was used to purify the chimera and protein with purity over 90% was achieved. The chimera was tested for its platelet membrane binding function and showed a calcium-dependent platelet binding activity. Amidolytic activity of the chimera was tested. The result indicated that specific amidolytic activity of plasmin activated chimera was 62000 IU/mg, comparable to the previously reported 65 355 IU/mg of plasmin activated natural proUK. Activation of plasminogen by the chimera after plasmin treatment followed Micbieal-Menten kinetics, and the Km was 0.97 μmol/L, which was also comparable to 1.64 μmol/L of native urokinase. The chimera also showed intensive ability to inhibit platelet aggregation in vitro. These results indicate that this chimera might be useful as a bifunctional thrombolytic agent.     

RGDS-尿激酶原嵌合体的构建与表达

利用定点突变及ＤＮＡ重组技术,构建了在尿激酶原Ｋ区Ｃ端的β发夹区插入了精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸〔ＲＧＤＳ〕片段的尿激酶原嵌合体基因,并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Ｓｆ９细胞对野生型及嵌合体尿激酶原进行了高效表达,表达量分别为１２００～１８００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）和１８００～２４００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）．经过ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析及超滤浓缩对野生型及突变型进行了部分纯化,并对其性质进行了初步研究．表明突变体尿激酶原保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性,并具有很强的抗血小板聚集活性．ＲＧＤＳ－尿激酶原嵌合体兼有溶栓及抗栓活性     

含RGD的配基与其受体相互作用研究进展

RGD配基与其受体相互作用目前已成为一个研究热点, 许多粘附蛋白是通过RGD序列与其整合素结合的, 它参与许多生物学过程. 文章主要就RGD序列肽与糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的相互作用及其在抑制血小板聚集上进行了较为全面的综述, 并介绍了RGD序列肽在基础科学及医疗上的应用前景.     

尿激酶原-RGDS双功能分子——构建、表达及性质研究

利用定点突变及DNA重组技术 ,构建了在尿激酶原K区C 端的β 发夹区插入了精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 丝氨酸 (RGDS)片段的尿激酶原嵌合体基因 ,并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Sf9细胞对嵌合体尿激酶原进行了高效表达 .用尿激酶原单抗亲和柱纯化表达产物 ,获得初步纯化的嵌合体蛋白 .对嵌合体蛋白进行血小板膜结合实验表明 ,此嵌合体具有依赖于钙离子的结合活化血小板膜的活性 .用生色底物Chromozym U测定嵌合体的酰胺解活性 ,结果显示 ,纤溶酶激活后的嵌合体比活为 62 0 0 0IU/mg,与文献报道的纤溶酶激活的尿激酶原比活 65 3 5 5IU/mg相近 .纤溶酶激活后的嵌合体激活纤溶酶原的反应符合米氏方程 ,其Km 值为 0 .97μmol/L ,与天然尿激酶的Km 值 1.64μmol/L相近 .嵌合体还显示了较强的体外抑制血小板聚集活性 .这些结果表明 ,此尿激酶原 RGDS嵌合体有可能成为一种新的双功能溶栓药物 .