米非司酮调控的单链鼠白介素12真核表达载体的构建及鉴定

构建含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,在体外鉴定其调控表达效果.用PcR技术从GCp35Ep40PN质粒上获取白细胞介素12的p40和p35亚基的基因,通过2次PCR技术引入linker后得到单链白细胞介素12基因,将其与米非司酮诱导调控系统克隆入pDC312质粒,构建成真核表达载体pDC-RumIL-12,通过限制性内切酶和PCR鉴定其正确性.在体外用脂质体转染法将pDc-RumIL-12载体转染HEK293细胞株,以不同的剂量米非司酮诱导载体表达,然后用ELISA法检测培养液上清中mIL-12蛋白的含量.测序结果表明所得鼠白细胞介素-12融合单链基因序列与设计相一致.酶切分析和PCR证实载体pDC-RumIL-12构建正确.将pDc-RUmlL-12转染HEK293细胞并经米非司酮诱导表达后,ELISA检测结果表明该栽体有良好的调控能力.没有诱导剂米非司酮时,只有极少量的mIL-12蛋白表达,而加入诱导剂米非司酮后,mIL-12表达量明显增加,并在一定范围内与米非司酮剂量呈正比.成功构建了含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核栽体,可用于肿瘤的基因治疗研究.     

携带红色荧光蛋白的RU486可诱导真核表达载体的构建及其表达

在基因治疗中, 实现目的基因的调控表达是非常重要的。然而, 传统基因载体的无调控地持续或不适当的表达会影响治疗效果, 甚至可能带来致命的副作用。在本研究中, 我们构建了一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体, 并在体外评估了其调控表达作用。利用分子生物学技术, 将DsRed基因和启动子, 以及RU486系统构建成单一的质粒载体PDC-RURED, 为减少RU486调控元件和基因表达元件之间的相互干扰, 在两者之间加入1.6 kb的绝缘子。经PCR检测和限制性酶切分析及序列测定均证实了载体的正确性。在转染HEK293细胞后, 运用荧光显微镜和流式细胞技术证实了该载体的调控能力。没有RU486时, 几乎没有红色荧光蛋白的表达, 而加入诱导剂RU486后, 最高可以实现红色荧光蛋白的40余倍的表达。实验结果表明构建的可经RU486诱导的新型真核表达载体可以实现对目的基因的表达时间和表达水平的调控, 为进一步的基因调控研究和和基因治疗提供了良好的工具。     

针对Oct-4和Survivin基因的双靶向shRNA腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞的抑制作用

转录因子Oct-4和Survivin是细胞增殖的关键调控因子,构建针对Oct-4和Survivin基因的双靶向shRNA腺病毒载体Ad5-Dual-shRNA,并研究其对肝癌细胞及移植瘤的生长抑制作用。合成Oct-4和Survivin基因的shRNA序列,插入腺病毒穿梭载体pDC312,含有shRNA的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞,经Cre/LoxP位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5-Dual-shRNA;腺病毒Ad5-Dual-shRNA感染肝癌细胞系EHBH-H1,经Western blotting检测Oct-4和Survivin基因的表达情况,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐染色法(MTT实验)和裸鼠荷瘤实验检测对肿瘤细胞生长的影响。研究结果显示,双靶向重组腺病毒Ad5-Dual-shRNA感染肝癌细胞系EHBH-H1能够有效沉默Oct-4与Survivin基因的表达,并且在MTT实验和裸鼠荷瘤试验中都显示出较单一靶向的shRNA腺病毒载体Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA具有更为明显的肿瘤细胞生长抑制作用。实验结果表明,特异性双靶向shRNA腺病毒载体Ad5-Dual-shRNA是一种更为高效的靶向肿瘤基因治疗载体。     

P16^INK4、Rb基因表达在肺癌发生中协调性研究

采用mRNA原位双杂交和免疫组织化学方法对31例非小细胞肺癌组织进行P16^INK、Rb基因、Rb基因表达水平及其相关性的研究。结果显示,以Dig-碱性磷酸酶－NBT／BCIP系统检测P16^INK4基因转录,阳性结果呈蓝色,阴性杂交率为22．6％（7／31）;以Bio－辣根过氧化物酶－AEC系统检测Rb基因转录,阳性结果为红色,阴性率为16．1％（5／31）。免疫组织化学检测显示P16^INK4蛋白质阴性率为42％（13／31）;Rb蛋白表达阴性率为19．4％（6／31）。Rb、P16^INK4基因在非小细胞肺癌发生中起协同调控作用,以P16^INK4基因表达异常为主。     

RU486诱导调控载体的构建及体外表达

构建可经RU486诱导表达载体,并证实其对基因表达的调控作用。通过分子生物学技术,改造了含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子的PRS质粒。PCR扩增BGHpolyA片段,并引入需要的酶切位点。在GLP65调控区上游添加了hCMV启动子,在GAL4杂合启动子下游加入了荧光素酶报告基因。同时,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2 kb的小鸡β珠蛋白绝缘子。经PCR和限制性酶切及测序证实了载体的正确性。在体外转染HEK293细胞后,运用双荧光素酶报告基因技术鉴定了该系统的调控能力。加入诱导剂RU486后,可以诱导表达荧光素酶,并在一定范围内两者呈正比,最高可以实现荧光素酶的40余倍的表达,而没有RU486时,几乎没有报告基因的表达,表明RU486诱导调控载体构建成功,可实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗提供了良好的工具。     

一株解淀粉芽孢杆菌生防蛋白的鉴定及分析

旨在鉴定一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌在NA液体培养基中的分泌蛋白中与生物防治相关的蛋白组分。采用蛋白质谱的方法对前期筛选到的一株拮抗葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌生防菌的在NA液体培养基中的分泌蛋白进行了鉴定。对鉴定到的蛋白采用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)的方法进行蛋白质组学分析,筛选与生物防治相关的蛋白。结果表明,从分泌蛋白中鉴定到了确定的53种蛋白质,其相对分子量大部分集中到0-100之间(占79.24%);涉及碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢、氨基酸代谢和生物防御等过程,以及作为细胞组分参与结构组成。发现了6种参与植物与病原菌互作的蛋白,2种属于氨基肽酶家族,4种参与几丁质的生物降解过程。