家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析

【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N. bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a（+）载体中进行诱导表达。通过SDS-PAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列（GenBank登录号为EOB13854.1）全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。